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2013年春季,我国长三角地区暴发了新型H7N9禽流感病毒疫情。截至2015年5月17日,我国累计报告人感染H7N9禽流感病例共661例,死亡267人,病例覆盖地区包括台湾省和香港地区共20个省市地区。这是继高致病性H5N1禽流感病毒之后,另一个受到全球关注的、并被认为有流感大流行潜能的禽流感病毒。该病毒是一种新型重配病毒,其HA基因来自家鸭中的H7亚型禽流感病毒,NA基因与野禽中的N9禽流感病毒高度同源,而6个内部基因全部来自H9N2禽流感病毒。同时该病毒发生了一些哺乳动物适应性变异,如HA的Q226L变异增加了病毒对人流感病毒受体的结合能力；PB2 E627K或者D701N的变异增加了病毒对哺乳动物的致病力。病毒被发现以后,很多研究团队对其起源和生物学特性进行了研究,并用多种动物模型评估了该病原的致病力和传播力。然而,尽管H7N9禽流感病毒的6个内部基因片段都来自H9N2禽流感病毒,但来源并不一样,从而形成了不同的基因型,不同基因型的H7N9禽流感病毒对哺乳动物的致病力和传播力表现并不清楚。此外,虽然有很多报道研究了单独PB2-E627K突变、或单独PB2-D701N突变、或双突变PB2-627E-701D对H7N9禽流感病毒在BALB/c小鼠中致病力的影响,但是E627K和D701N共突变对H7N9禽流感病毒的有何影响还不清楚,且还有哪些潜在的影响H7N9禽流感病毒致病力的分子标记也未见报道。本研究首先比较了疫情早期人群中9种不同基因型的H7N9禽流感病毒代表株在C57BL/6小鼠中致病力的差异。结果发现,不同基因型H7N9禽流感病毒代表株在小鼠中的致病力不同,有些对小鼠的致病力较强,有些对小鼠的致病力较弱。本研究随后选择对C57BL/6小鼠致病力较强的代表株A/Anhui/01/2013 (AH01, H7N9)病毒,以及对小鼠致病力较弱的代表株A/Shanghai/05/2013 (SH05,H7N9)病毒,在雪貂中比较它们传播力的差异。结果发现,对小鼠致病力较强的AH01病毒,在雪貂中不仅可以通过直接接触非常有效的传播,而且可以通过空气进行传播；而对小鼠致病力较弱的SH05病毒,在雪貂中只能通过直接接触发生有限传播,但完全不能通过空气传播。通过对SH05和AH01两株病毒进行序列比对,结果发现SH05病毒的PB2-627位点氨基酸为谷氨酸(E),而AH01病毒的PB2-627位点氨基酸为赖氨酸(K)。我们同时分别对直接接种SH05和AH01病毒,以及通过直接接触或者空气传播感染了SH05或AH01病毒的雪貂鼻洗液进行二代测序分析,结果发现野生型SH05 (PB2-627E-701D)和AH01 (PB2-627K-701D)两株H7N9禽流感病毒,在雪貂直接接触传播的过程中发生了PB2-E627K和/或PB2-D701N突变,提示PB2-E627K和/或PB2-D701N突变在H7N9在哺乳动物的适应过程中很容易发生。本研究随后利用反向遗传学技术,在体外和小鼠体内研究PB2-627和PB2-701两个位点四种不同氨基酸组合对H7N9禽流感病毒的影响。结果发现,PB2-627K和701N组合不仅可以增加H7N9禽流感病毒的聚合酶活性,而且可以增加病毒在人源细胞中的复制和在小鼠中的致病力；另一组突变,627E和701D组合,虽然降低了H7N9禽流感病毒的聚合酶活性,但同样可以增加H7N9禽流感病毒在人源细胞中的复制力和在小鼠中的毒力。通过将H7N9禽流感病毒的聚合酶复合物基因和家禽中流行的G1-like代表株A/Quail/Hongkong/G1/1997 (G1, H9N2)的聚合酶复合物基因进行重组后,发现G1病毒的NP基因可显著提高H7N9禽流感病毒的聚合酶活性。进一步研究发现NP蛋白上的两个氨基酸41V和201D不仅可以增加H7N9禽流感病毒的聚合酶活性,而且还很有可能增加H7N9禽流感病毒在低温条件下的复制力。综上所述,本研究首次发现不同基因型H7N9禽流感病毒在哺乳动物中的致病力和传播力不同,且H7N9禽流感病毒在哺乳动物的适应过程中很容易发生PB2蛋白E627K和D701N的突变；PB2-627K-701N组合和PB2-627E-701D组合均能增加H7N9禽流感病毒在小鼠中的致病力；此外,NP-41V和NP-210D氨基酸突变可能增加H7N9禽流感病毒的复制力。对带有上述氨基酸位点的H7N9病毒,应适当提高警惕。