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精子是雄性将遗传信息和种质传递给后代的载体。因此,正常的精子发生对于保护物种和遗传多样性具有至关重要的作用。而正常的精子发生依赖于正确的基因表达调控作用。piRNA是在生殖系细胞中发现的一类小RNA,已有的研究表明piRNA可能参与表观遗传学调控、基因转位抑制、转录后调控等。PIWI是piRNA的结合蛋白,以piRNA/PIWI复合体的形式发挥功能。本课题的目的就在于分离纯化不同分化发育阶段的小鼠雄性生殖细胞,为将来从体内体外两方面研究piRNA和PIWI之间的相互关系以及piRNA/PIWI复合体的代谢打下基础。小鼠雄性生殖细胞主要包括精原细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞这几类,本论文首先建立了精原细胞的特异性鉴定方法。我们应用免疫荧光技术对mvh和vimentin在睾丸组织中的表达定位进行了检测分析,其中mvh主要在生殖细胞中表达,体细胞中无表达,而vimentin则主要在体细胞中表达,生殖细胞中无表达,二者的信号无重叠,由于我们选用7-8日龄的小鼠来分离精原细胞,此时未有其他时期的生精细胞,因此,最终我们确定了mvh为精原细胞的分子MARKER,vimentin为支持细胞的分子MARKER.在确定了精原细胞的分子MARKER之后,我们首先考察了对曲细精管的几种消化方法,其中程序性复合酶消化法的得率最高,20只小鼠可获得4×107个细胞,接着根据精原细胞和支持细胞贴壁速度的不同,通过差异贴壁法富集了精原细胞,然后通过mvh,stra 8,vimentin这三个分子MARKER,采用1F和流式细胞仪检测来鉴定纯度,最终获得了纯度在70%-80%之间的精原细胞。随后,在用程序性复合酶消化法从5周龄小鼠睾丸中获得生精细胞混悬液后,我们比较了percoll不连续密度梯度离心法和STAPUT即BSA连续密度梯度重力沉降法的纯化效率,STAPUT法为percoll法的10倍,因此,我们采用该法纯化初级精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞,并对纯化后的细胞进行免疫荧光和流式细胞术鉴定,纯度分别达到了66%,54%和69%。综上所述,本课题成功建立了小鼠精原细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞的分离纯化与鉴定的方法。下一步将在此基础上对PIWI进行体内和体外的研究。