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第一部分:低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响[目的]TMZ如今被当作第一线药物用来治疗脑胶质瘤。MGMT是一种DNA修复酶,可以对烷化剂药物造成的DNA损伤进行修复,也会进一步使肿瘤细胞产生耐药性。按照脑胶质瘤细胞表达MGMT的高低,脑胶质瘤细胞可以分为MGMT高表达细胞和MGMT低表达细胞。其中T98G细胞为高表达细胞,U87细胞为低表达细胞。此部分研究通过模拟肿瘤体内低氧微环境,选择高浓度替莫唑胺干预T98G细胞,低浓度替莫唑胺干预U87细胞,培养后检测增殖及凋亡情况。[方法]将T98G细胞及U87细胞设为常氧对照组(21%02)、常氧+替莫唑胺实验组(21%02+TMZ)、0.5%低氧+替莫唑胺实验组(0.5%O2+TMZ)和5%低氧+替莫唑胺实验组(5%02+TMZ),细胞贴壁后,T98G加1mmolTMZ,U87加0.1mmolTMZ培养72h;倒置显微镜下观察生长情况;利用MTS法检测吸光度即增值情况;AnnexinV/PI相关处理染色之后,利用流式细胞仪检测其凋亡情况。[结果]MGMT高表达的T98G细胞在倒置显微镜下的生长情况:常氧实验组形状细长;0.5%低氧实验组排列分散、突起不明显;5%低氧实验组形状细长、突起不明显。T98G细胞吸光度:常氧对照组(0.64±0.05);常氧实验组(0.43±0.12);0.5%低氧实验组(0.61±0.06);5%低氧实验组(0.40±0.04)。0.5%低氧实验组吸光度即增殖率高于常氧实验组(P<0.05)。T98G细胞凋亡率:常氧对照组(19.57±1.61);常氧实验组(37.83±9.46);0.5%低氧实验组(34.63±0.98);5%低氧实验组(21.10±3.58)。5%低氧实验组凋亡率低于常氧实验组(P<0.05)。MGMT低表达的U87细胞在倒置显微镜下的生长情况:常氧实验组形状细长:0.5%低氧实验组形状细长;5%低氧实验组形状细长、排列分散。U87细胞吸光度:常氧对照组(0.56±0.05);常氧实验组(0.44±0.07);0.5%低氧实验组(0.51 ±0.05);5%低氧实验组(0.35±0.06)。0.5%低氧实验组吸光度即增殖率高于常氧实验组(P<0.05)。U87细胞凋亡率:常氧对照组(3.25±1.22);常氧实验组(8.10± 1.10);0.5%低氧实验组(6.64±0.89);5%低氧实验组(4.84±1.78)。5%低氧实验组凋亡率低于常氧实验组(P<0.05)。[结论]适度的低氧微环境可以减弱TMZ对脑胶质瘤细胞的影响,产生耐药性,抵抗化疗作用。第二部分:低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞BCL-2表达的影响[目的]在梯度低氧微环境下培养MGMT高表达的T98G细胞及MGMT低表达的U87细胞。给予预先确定的替莫唑胺浓度处理后,检测bcl-2的表达,用以验证低氧微环境下脑胶质逃避TMZ的凋亡诱导是通过上调bcl-2表达实现的。[方法]通过三气培养箱建立梯度低氧微环境;将脑胶质瘤细胞T98G细胞及U87细胞设为常氧对照组(21%O2)、常氧+替莫唑胺实验组(21%O2+TMZ)、0.5%低氧+替莫唑胺实验组(0.5%O2+TMZ)和5%低氧+替莫唑胺实验组(5%O2+TMZ),细胞贴壁后,T98G细胞加1mmolTMZ,U87细胞加0.1mmolTMZ培养72h,通过western blot访法检测各组bcl-2表达情况,以此来验证低氧微环境下替莫唑胺对bcl-2的影响。[结果]检测到bcl-2在脑胶质瘤细胞T98G中的表达量由高到低依次为:常氧对照组、0.5%低氧实验组、5%低氧实验组、常氧实验组。检测到bcl-2在脑胶质瘤细胞U87中的表达量由高到低依次为:常氧对照组、0.5%低氧实验组、5%低氧实验组、常氧实验组。[结论]适度低氧微环境可以减弱TMZ的作用,通过上调bcl-2在脑胶质瘤细胞中的的表达,产生耐药性;低氧微环境与MGMT可能是产生耐药的的独立或者协同因素。