细粒棘球蚴重组抗原14-3-3和苹果酸脱氢酶诱导宿主DC-CD4+T细胞免疫应答机制的研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:emmagarden
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目的:通过比较不同免疫保护力的细粒棘球蚴重组抗原14-3-3(rEg14-3-3)和线粒体苹果酸脱氢酶(rEgmMDH)对宿主树突状细胞(dendriticcell,DC)的成熟、DC细胞递呈并促进CD4+T细胞活化、分化及效应的影响,研究细粒棘球蚴抗原所诱导的宿主免疫应答机制。方法:1.抗原的获取:①重组抗原的表达:通过原核表达以及亲和层析纯化获得细粒棘球蚴重组抗原rEg14-3-3和rEgmMDH,并复性获取可溶性蛋白rEgmMDH;②天然粗抗原的制备:外科手术剥离细粒棘球蚴病人的包囊并无菌收集囊液和分离原头蚴,原头蚴经液氮研磨和超声破碎获取可溶性抗原。2.小鼠骨髓来源的DC(BMDC)的制备和培养:无菌分离小鼠骨髓细胞,通过GM-CSF、IL-4定向培养7天,获取未成熟DC。3.不同抗原刺激BMDC的扫描电镜及流式细胞术检测:LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原头蚴粗抗原和囊液分别刺激未成熟BMDC48小时,扫描电镜观察各组BMDC表面形态特征,流式细胞术检测各组BMDC的表面分子(MHCⅡ、CD40、CD80和CD86)和极化因子(IL-12和CCL2)的表达水平。4.混合淋巴细胞反应(MLR)及流式细胞术检测:无菌分离正常小鼠脾脏单个淋巴细胞,通过磁珠分选分离纯化小鼠脾脏初始CD4+T细胞。LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原头蚴粗抗原和囊液刺激培养的BMDC分别与初始CD4+T细胞按1:5的比例混合培养5天。流式细胞术检测混合淋巴细胞反应(MLR)后Th1,Th2,Th17和Treg细胞占CD4+T细胞的比例。结果:1.获得高纯度的可溶性重组抗原rEg14-3-3和rEgmMDH,以及无菌的囊液抗原和原头蚴可溶性抗原。2.①扫描电镜观察结果显示LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、SPA和HF抗原刺激的DC细胞均有部分分化为具有树突状突起的DC。②流式细胞术检测各组抗原刺激BMDC的结果显示,与PBS相比,相应浓度的LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原头蚴可溶性抗原和囊液均能刺激BMDC高表达MHCⅡ类分子和CD40(P<0.05)。与PBS相比,BMDC在相应浓度的LPS、rEg14-3-3、原头蚴可溶性抗原刺激后,可高表达CD80和CD86(P<0.05),而相应浓度的rEgmMDH刺激的BMDC低表达CD80(P>0.05),相应浓度的囊液刺激的BMDC低表达CD86(P>0.05)。③比较分析rEg14-3-3组和rEgmMDH组BMDC表面分子的表达水平,经抗原rEg14-3-3刺激后的BMDC较高水平表达MHCⅡ类分子、CD80和CD86(P<0.05)。④相应浓度的LPS和rEgmMDH能刺激DC表达较高水平的极化因子IL-12(P<0.05),相应浓度的rEg14-3-3和囊液能刺激DC表达较高水平的极化因子CCL2(P<0.05)。3.流式细胞术分析混合淋巴细胞反应后的CD4+T细胞,结果显示,①与PBS相比,LPS、rEg14-3-3和rEgmMDH能诱导初始CD4+T细胞分化较高水平的CD3+CD4+IFN-γ+T细胞(P<0.05),而且比较rEg14-3-3和rEgmMDH组CD3+CD4+IFN-γ+T细胞的分化水平,无统计学差异(P>0.05);②rEg14-3-3、囊液抗原能诱导初始CD4+T细胞分化较高水平的CD3+CD4+IL-4+T细胞(P<0.05);③rEgmMDH能诱导初始CD4+T细胞显著分化高水平的CD3+CD4+IL-17+T细胞(P<0.05);④LPS、rEgmMDH、原头蚴可溶性抗原能诱导初始CD4+T细胞分化较高水平的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞(P<0.05)。结论:1.与未获得免疫保护力的抗原rEgmMDH相比,抗原rEg14-3-3更容易诱导DC成熟。2.体外实验显示rEg14-3-3负载DC后优势诱导初始CD4+T细胞活化为高水平的Th1、Th2细胞亚群,rEgmMDH负载DC后优势诱导初始CD4+T细胞活化为高水平的Th1、Th17、Treg细胞亚群。具有不同免疫保护力的抗原可能通过DC诱导CD4+T细胞分别向不同的方向分化,从而发挥抗感染作用。
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