大气污染已被确认为是人类致癌物。随着我国城市化工业化的发展,大气污染已经成为严重影响公众健康的主要环境因素之一。颗粒物(particulate matter,PM)污染是一种重要的大气污染,它是分散于空气中的固体颗粒与液体微滴的混合物。可吸入颗粒物按其粒径(空气动力学直径)大小大致可分为：直径≤10μmm的粗颗粒物(PM1o)和直径≤2.51μm细颗粒物(PM2.5)。大量的流行病学和毒理学研究表明,PM2.5对健康的危害比PM1o更严重,其与心肺疾病甚至与肺癌的发生密切相关。PM2.5空气污染问题已成为中国面临的严峻挑战。2010年PM2.5空气污染居全球20个首要致死风险因子的第9位,而在中国则排在第4位。2011年,在中国死因前四位的疾病分别为：脑卒中、肺部疾病、冠心病和肺肿瘤,这四种疾病均与PM2.5有关。在过去的几十年里,PM2.5和人类健康的科学研究已经有多个报道,研究表明PM2.5会对细胞产生细胞毒性,然而其细胞毒性的复杂机制尚未完全清楚。为进一步全面地揭示PM2.5对人支气管上皮(Human bronchial epithelial, HBE)细胞的毒性作用及其潜在的作用机制,我们将采集武汉市城区空气中的PM2.5,结合体外培养、流式细胞术、全基因组芯片和生物信息学分析等实验方法,开展如下研究：(1)探讨空气中PM2.5对HBE细胞的毒性作用；(2)初步探讨PM2.5对HBE细胞全基因组表达谱的影响；(3)初步探讨PM2.5对HBE细胞DNA甲基化谱的影响。本课题从全基因组表达水平和表观遗传学角度研究PM2.5对HBE细胞的细胞毒性机制,为进一步揭示PM2.5致健康损害的生物学机制提供理论依据和重要线索。第一部分PM2.s对人支气管上皮细胞的毒性作用目的：PM2.5是大气污染的主要成分之一,主要来自于机动车尾气排放、化石燃料(石油、煤炭等)的燃烧、生物质燃料的燃烧等。其表面吸附了大量的有毒有害物质(如多环芳烃和过渡金属),可通过呼吸而沉积在呼吸道和肺泡中,甚至可以通过气血屏障进入血液循环,引起机体呼吸系统和心血管系统等较为广泛的损害。本研究拟通过体外实验方法,检测PM2.5对HBE细胞存活率、细胞周期及细胞凋亡的影响,以探讨PM2.5对人支气管上皮细胞的毒性作用。方法：肺是PM2.5作用的主要靶器官,因此,本课题以HBE细胞为研究对象。采集武汉市城区空气中的PM2.5并将其制成颗粒物悬液对细胞进行暴露处理。采用CCK-8(cell counting kit-8,细胞计数试剂盒)细胞增殖实验检测空气中PM2.5对HBE细胞活性的影响。该实验共设9个组别,分别为：对照组(Oμg/ml)、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、700μg/ml和800μg/ml,处理时间设为24h和48h。根据CCK-8实验结果,选择24h的处理时间来进行后续的所有实验。为尽可能使细胞暴露浓度与人类暴露浓度相一致,本研究对人每日PM2.5暴露浓度进行了预测。成年人每天大约要呼吸20m3的空气,而人气道和肺里的液体的平均体积为12.4ml。按照采样期间空气PM2.5的日平均浓度(115μg/m3)计算,成年人日均PM2.5暴露浓度应该为185μg/ml。而根据之前测得的武汉市空气PM2.5的浓度,其最高值为358μg/m3,相应的成年人日均最高暴露浓度应为577μg/ml。对于24h处理组,当PM2.5浓度为200μg/m1时,细胞存活率与对照组相比差异开始具有统计学意义。当浓度为500μg/ml时,细胞存活率约达到60%。因此,联合预测的人均暴露浓度,选择200gg/ml作为低浓度组暴露浓度,500μg/ml作为高浓度组暴露浓度来进行后续实验。采用流式细胞术实验方法,观察PM2.5对细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：CCK-8实验结果显示,PM2.5干预HBE细胞24h后,与对照组相比,经不同浓度PM2.5处理过的HBE细胞活性均下降,除了100μg/ml组(存活率为99.1%)以外,其他浓度组均存在统计学差异。PM2.5干预HBE细胞48h后,与对照组相比,经不同浓度PM2.5处理过的HBE细胞活性均下降,每个浓度组均存在统计学差异。同时,PM2.5的浓度和细胞存活率之间具有显著的剂量效应关系(r=0.99,P<0.01)。然而,在相同浓度条件下比较24h处理组和48h处理组对细胞存活率的影响,其结果无明显统计学差异(P>0.05)；在相同的PM2.5浓度下,24h的暴露时间和48h的暴露时间对细胞存活率的影响也无明显统计学差异(P>0.05)。细胞周期实验结果显示,低浓度组(200μg/m1)在G1期的细胞比例为71.54%,高浓度组(500gg/m1)为67.58%,与对照组(76.42%)相比均显著降低(P<0.05)。随处理组浓度升高,S期细胞比例有升高的趋势(对照组14.13%、低浓度组19.18%、高浓度组23.45%),其中高浓度组差异有统计学意义(P<0.05)。G2期各浓度组细胞比例与对照组相比无明显统计学差异(P>0.05),但随浓度升高有下降的趋势(对照组9.44%、低浓度组9.28%、高浓度组8.96%)。细胞凋亡实验结果显示,高浓度组的细胞总凋亡率(3.70%)比对照组(3.17%)稍高,但是低浓度组和高浓度组的细胞总凋亡率与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论：PM2.5具有抑制HBE细胞增殖的作用,并且其浓度与细胞活性之间呈明显的剂量效应负相关关系。另外,PM2.5可诱导HBE细胞周期阻滞。第二部分PM2.5对人支气管上皮细胞基因表达谱的影响目的：PM2.5具有抑制HBE细胞增殖,诱导细胞周期阻滞的作用。然而其机制尚不完全清楚,PM2.5的毒性作用可能会对细胞基因表达谱造成一定影响。为全面的了解大气细颗粒物PM2.5对HBE细胞的影响,本部分将初步探讨PM2.5对HBE细胞全基因组表达谱的影响。方法：采用Agilent mRNA单通道表达谱芯片检测PM2.5对HBE细胞全基因表达谱的影响。运用RT-PCR实验验证芯片结果的可靠性。对于表达谱芯片结果数据的分析,首先,筛选出PM2.5处理后差异表达的基因。然后,运用分子功能注释系统3.0(MAS3.0)对筛选出的差异表达基因进行Gene Ontology(GO)功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。结果：全基因组表达谱芯片实验发现,低浓度(200μg/ml)和高浓度(500μg/ml)处理组中分别有970个和492个基因出现明显的差异表达。GO分析发现差异基因与炎性应答(inflammatory response)、免疫应答(immune response)、氧化应激反应(response to oxidative stress)、DNA损伤刺激应答(response to DNA damage stimulus)等相关。Pathway分析结果显示,低浓度组和高浓度组分别有58个和13个差异表达基因显著富集的KEGG通路,并且高浓度组中的12个KEGG通路均与低浓度组中的相同,分别为p53信号通路(p53signaling pathway)、凋亡(apoptosis)、肌动蛋白细胞骨架调节(regulation of actin cytoskeleton)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、细胞因子与细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、核糖体(ribosome)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、泛素介导的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、核苷切除修复(nucleotide excision repair)、甾类合成(biosynthesis of steroids)、嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)、嘌呤代谢(purine metabolism)在低浓度组中,显著富集的细胞周期和细胞凋亡通路与其GO分析结果相吻合。实时定量PCR的数据结果与芯片结果存在很好的一致性(r=0.965,P<0.001),证明表达谱芯片结果可靠。结论：PM2.5可以显著影响HBE细胞的基因表达谱,并且,暴露浓度对基因表达谱的改变方式有着重要的影响。而PM2.5诱导的差异表达基因参与的多种生物学过程可能与PM2.5的毒性作用机制相关。第三部分PM2.s对人支气管上皮细胞DNA甲基化谱的影响目的：DNA甲基化作为一种主要的表观遗传学修饰模式,可通过多种方式调控基因的表达。有研究表明,空气中的颗粒物可诱发DNA甲基化修饰状态的改变。Kile等的一项流行病学研究显示,PM25暴露可增加iNOS基因启动子区的甲基化率,-并且暴露时间越久其甲基化率增加约明显。动物实验研究发现,经PM2.5处理后的小鼠和原代小鼠肺泡上皮细胞中,DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达水平和抑癌基因p16的启动子区甲基化水平都有增加,由此推测PM2.5可能通过DNMT1异常上调而导致主要肿瘤抑制基因的高甲基化,进而增加患肺癌的风险。为了从表观遗传学的角度全面地探索PM2.5对HBE细胞毒性作用的潜在分子学机制,本课题将从全基因组水平检测空气中PM2.5对HBE细胞DNA甲基化谱的影响。方法：采用NimbleGen MeDIP甲基化芯片实验从全基因组水平检测空气中PM2.5对HBE细胞DNA甲基化谱的影响。运用MSP实验验证甲基化芯片结果。对于DNA甲基化芯片结果数据的分析,首先筛选出PM2.5处理后的差异甲基化基因并对这些基因进行GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。然后,将甲基化谱芯片结果与基因表达谱芯片结果进行联合分析,找出与DNA甲基化状态相关的差异表达基因,即在上述筛选出的差异甲基化基因中找出低甲基化伴随高表达的基因和高甲基化伴随低表达的基因。结果：根据差异甲基化基因筛选原则((a)有显著富集意义的甲基化区域评分≥2.0；(b)与对照相比,甲基化差异Log-Ratio≥1.0或≤-1.0),在低浓度组(200gg/m1)与对照组比较中发现有146个差异甲基化基因,其中高甲基化基因98个,低甲基化基因47个；在高浓度组(500μg/ml)与对照组比较中共有119个差异甲基化基因,其中高甲基化基因67个,低甲基化基因52个。Pathway分析结果显示,低浓度组差异甲基化基因显著富集的KEGG通路主要有紧密连接(tight junction)、p53信号通路(p53signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)和小细胞肺癌(small cell lung cancer)。高浓度组差异甲基化基因显著富集的KEGG通路有5个：氨酰-tRNA合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、含硒氨基酸代谢(elenoamino acid metabolism)、组氨酸代谢(histidine metabolism)、碱基切除修复(base excision repair)和嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)。GO分析结果显示,低浓度组和高浓度组根据统计学P值大小排名前十的生物学途径有4个相同,为DNA依赖的转录调控(regulation of transcription,DNA-dependent)、转录(transcription)、从RNA聚合酶Ⅱ启动子区转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、和信号转导(signal transduction)。与表达谱芯片联合分析结果显示,与对照组相比,在低浓度组中有14个高甲基化差异基因(HSPB3、RXRG、CXXC1、CDH4、 ACTRT1、CXXC5、EDNRA、PPM1D、AFF1、MEPE、NDUFB1、MYF5、SDR42E1. RPL23A)伴随有低表达差异,5个低甲基化差异基因(SCARNA15、LOC116437、 MAGT1、Clorf159、CREB1)伴随有高表达差异；在高浓度组中则有8个高甲基化差异基因((CENPK, LLC1、OR1F2P、FOLR1、NRIP3、PFN3、SOX6、ZFHX4)伴随有低表达差异,6个低甲基化差异基因(GGPS1、CPNE2、WDR33.A4GNT, LYPD3、HMGA2)伴随有高表达差异。MSP实验结果表明经PM2.5处理过后,相较于对照组,低浓度组中的RXRG与高浓度组中的LLC1均存在高甲基化。同时,经RT-PCR验证,与对照组相比,这两个基因在各处理组中也存在着低表达情况,证明芯片结果可靠。结论：PM2.5可以显著影响HBE细胞中的DNA甲基化状态,引起大量基因的差异甲基化,并且其中一些基因甲基化状态的改变可能与其基因表达相关。