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慢性肝病是一类世界性的严重危害人类健康的疾病,预防肝纤维化的发生是这个过程的中间及关键环节,其中心事件是由于肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSCs）的激活导致细胞外基质（extracellular matrix, ECM）生成过多、降解相对不足。诱导活化的HSCs的凋亡可使肝纤维化发生逆转。越来越多的研究认为HSCs的活化和增殖与其凋亡受到抑制有密切的关系,而核转录因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）与细胞凋亡关系密切。NF-κB是由Rel蛋白家族p65和p50组成的同源或异源二聚体,其与一种NF-κB抑制物（inhibitor ofκB, IκB）结合,存在于胞质内而无活性。NF-κB可以被多种刺激物所激活,如TNF-α、IL-1、脂多糖等,这些刺激物可以通过对IκBs的磷酸化而使其降解,并与NF-κB解离,暴露NF-κB的核识别位点,使其进入核内,促进下游的靶基因的转录。HSCs的活化伴有NF-κB的激活,并在活化中起着重要作用。在静止态HSCs中NF-κB并无活性,但在激活态HSCs中,活性却持续存在,因此有理由相信NF-κB可能通过抑制HSCs的凋亡而使活化的HSCs数量维持在相当的水平,最终导致肝纤维化的发生。研究表明,NF-κB的抑制剂有抗肝纤维化的作用,说明抑制NF-κB后能使肝纤维化发生逆转。双环醇（bicyclol）临床应用于治疗慢性乙型肝炎显示较好的效果。近年研究表明双环醇有抗肝纤维化的作用,但其作用机制目前尚未明确。为此,本研究应用体外细胞培养技术,以H2O2激活HSCs NF-κB,研究双环醇对NF-κB亚单位p65表达的抑制作用。目的:研究双环醇对H2O2诱导的HSCs NF-κB活化调控机制。方法:采用体外细胞培养技术培养HSCs,以相同浓度的H2O2 （2μmol/ L）按时间梯度刺激细胞,应用RT-PCR方法检测NF-κB p65 mRNA表达,Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达情况。并用双环醇预处理细胞后,观察上述指标变化。结果:①H2O2对HSCs NF-κB p65表达的影响: RT-PCR结果显示,12h组、24h组mRNA表达量分别为1.32±0.08,2.15±0.21,与对照组0.53±0.12比较,表达量增加, P<0.05,有统计学差异;36h组mRNA表达量1.82±0.15与对照组0.53±0.12比较,表达量增加, P<0.05,有统计学差异,与24h组2.15±0.21比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异。Western blot分析结果显示,在大约56kD位置出现NF-κB p65特异性条带。与正常对照组相比, NF-κBP65蛋白表达均增加,且随作用时间变化而变化。12h组、24h组蛋白表达量分别为1.58±0.07,2.34±0.22,与对照组0.61±0.11比较,表达量增加, P<0.05,有统计学差异;36h组蛋白表达量1.92±0.15与对照组0.61±0.11比较,表达量增加, P<0.05,有统计学差异,与24h组2.34±0.22比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异。由此可见与正常对照组相比,NF-κB p65表达明显升高后逐渐下降,表达于24h达高峰。因此下面的实验应用终浓度为2.0umol/L H2O2作用HSCs 24h后收集细胞。②不同浓度的双环醇对H2O2诱导的HSCs NF-κB p 65mRNA及蛋白表达的抑制作用。RT-PCR结果显示,0.3mmol/L组、0.5mmol/L组mRNA表达量分别为1.34±0.03,0.63±0.05,与对照组2.13±0.21比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异;1.0mmol/L组mRNA表达量0.59±0.17与对照组2.13±0.21比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异,与0.5mmol/L组0.63±0.05比较,表达量略有降低,但P>0.05,无统计学差异。Western blot分析结果显示,在大约65kD位置出现NF-κB p65特异性条带。与对照组相比,NF-κB p65蛋白表达较对照组均降低,且随作用浓度变化而变化。0.3mmol/L组、0.5mmol/L组蛋白表达量分别为1.41±0.06,0.70±0.12,与对照组2.35±0.19比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异;1.0mmol/L组蛋白表达量0.68±0.15与对照组2.35±0.19比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异,与0.5mmol/L组0.70±0.12比较,表达量略减低,但P>0.05,无统计学差异。由此可见与正常对照组相比,NF-κB p65表达逐渐下降,于0.5mmol/L表达最低。③不同时间的双环醇对H2O2诱导的HSCs NF-κB p65的mRNA及蛋白表达的抑制作用。RT-PCR结果显示,30min组、60min组mRNA表达量分别为1.31±0.05,0.74±0.18,与对照组2.16±0.20比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异;90min组mRNA表达量0.69±0.14与对照组2.16±0.20比较,表达量降低,P<0.05,有统计学差异,与60min组0.74±0.18比较,表达量略有降低,但P>0.05,无统计学差异。Western blot分析结果显示,在大约65kD位置出现NF-κB p65特异性条带。与对照组相比,0.5mmol/L不同时间作用于HSCs NF-κB p65条带均变细,颜色均变浅。NF-κB p65蛋白表达较对照组均降低,且随作用时间变化而变化。30min组、60min组蛋白表达量分别为1.53±0.11,0.79±0.15,与对照组2.33±0.24比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异;90min组蛋白表达量0.77±0.19与对照组2.33±0.24比较,表达量降低, P<0.05,有统计学差异,与60min组0.79±0.15比较,表达量略降低,但P>0.05,无统计学差异。由此可见与正常对照组相比,NF-κB p65表达逐渐下降,于60min表达最低。结论:①H2O2可以引起HSCs NF-κB p65的活化,在相同浓度H2O2 （2μmol/L）的作用下,NF-κB p65的mRNA及蛋白表达有时间依赖性,最大表达量的作用时间点为24h。②H2O2对于HSCs NF-κB p65表达的调控作用可被双环醇呈浓度、时间依赖的方式抑制,并与0.5mmol/L 60min抑制性最强,提示氧化应激可诱导NF-κB激活,双环醇有抗氧化作用,这可能是双环醇抗肝纤维化的一个重要的机制。