1．实验室建立SNP标记开发技术分子标记在高密度遗传图谱构建、性状作图和基因的精确定位、群体遗传结构分析以及系统发育分析等方面均具有广阔的应用前景。SNP分子标记是继限制性片段长度多态性标记（RFLP）和微卫星标记(SSR)之后的第三代分子标记。它数量多，覆盖密度大，位点丰富，几乎分布于整个基因组；具有片段短易于扩增、遗传稳定性强等特点；易于高通量、自动化分析；易于遗传机制的研究等。本文将高分辨率熔解曲线技术与生物信息学分析相结合，为实验室建立了SNP标记开发的新途径，其技术路线为：应用Megablast-VectorNTI软件，对同一物种大量序列进行聚类、拼接，从重叠群中筛选出候选SNP；然后设计引物探针做不对称PCR，扩增出包含有单链的目的片段产物；将探针加入到扩增产物中使之与单链目的片段进行杂交；最后将杂交产物置于Light Scanner分析仪中采集曲线，应用相关软件进行基因分型确认SNP位点。本方法所用软件操作简便，而且所用仪器实现了低成本、高精度、高通量的闭管操作，大大降低了实验过程中可能的污染造成的误差。该方法不需要已知突变位点，可直观、快捷地检测个体SNP位点的遗传变异情况，获得该位点的个体基因型，为以后与传统方法相结合育种工作奠定基础。2.大菱鲆SNP标记的开发本实验利用Vector NTIAdvance11分析数据库中大菱鲆全部的12428条EST序列，在分析的重叠群中，严格遵守候选SNP筛选标准进行筛选，然后根据筛选的候选SNP位点设计引物、探针。通过不对称PCR、分子杂交等步骤，应用高分辨率熔解曲线分析仪（HRM）采集数据，运用配套软件对来源于8个家系的10个不同性状群体进行基因分型。研究结果显示，从分析的序列中共得到1457个重叠群和2738个单一序列，在1457个Contigs重叠群中，Contig size(组成Contig的EST序列数)最大值为411，平均值为6.65个EST序列。其中包含4个及其以上的EST序列的重叠群共有522个。从522个重叠群中共筛选出160多个候选SNP位点，从中挑选56个位点用于本实验。结果表明，能扩增出目的片段的引物有37条，合45个位点，成功率为66.1%。不对称PCR后，能与DNA分子杂交的探针有13条，杂交率为28.9%。本实验中能成功进行基因分型的位点共有8个，占杂交位点的61.5%，其中有6个为碱基替换型位点，即G-A占3个，C-T占3个，2个为碱基颠换型位点，即T-G和A-T各占1个。本文SNP标记的开发是基于公共数据库中的EST序列信息，它们与表达基因紧密相关或直接位于基因的编码区内，它们多于免疫相关，这将为今后的大菱鲆基因组比较及基因定位和克隆研究奠定基础，为今后的大菱鲆的遗传改良，培育出具有优质、高产、抗逆等优良性状的新品种研究奠定基础。在硕士期间完成的其他的工作：大菱鲆雌核发育家系构建本文对大菱鲆异源精子减数分裂雌核发育条件做了简要的摸索，即固定冷休克水温0±0.2℃、冷休克起始时间6min30s，冷休克持续时间25min，设置紫外线照射剂量梯度为：250μj/cm2×1min、250μj/cm2×0.9min、250μj/cm2×0.8min来摸索最佳紫外线照射剂量；固定精子的照射剂量250μj/cm2×0.9min，固定冷休克的处理持续时间25℃和处理水温0±0.2℃，将冷休克起始时间设置为受精后5min30s、6min30s、7min30三个梯度来摸索最佳冷休克起始时间。在此基础上构建了5个大菱鲆减数分裂雌核发育家系，并观察了雌核发育家系胚胎发育和幼体培育的过程。结果表明，在冷休克水温为0±0.2℃、冷休克持续时间为25min的条件下，利用冷冻真鲷精子诱导大菱鲆减数分裂雌核发育最佳处理条件为：紫外线照射剂量为250μj/cm2×0.9min，冷休克起始时间为6min30s；按照摸索实验的最佳条件，对5条大菱鲆亲鱼做雌核发育，构建了5个大菱鲆雌核发育家系，处理卵量200-400mL不等，共得到雌核发育二倍体仔鱼5000余尾，经培育共得到400余尾17月龄雌核发育二倍体。本实验验证了雌核发育的条件的稳定性，为大菱鲆雌核发育应用的研究提供了理论依据。雌核发育是一种非常理想的遗传性别控制技术，应用于生产实践中可以大幅度地提高养殖产量和增加经济效益。同时，利用雌核发育技术可以快速构建鱼类若干纯系，这对于鱼类育种的工作而言具有广泛的应用前景。