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目的: 研究重组人促血小板生成素(recombinant human thrombopoietin,rhTPO)在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)化学性缺氧的保护作用及可能的机制。为临床上治疗缺血缺氧性脑损伤寻求更为有效的治疗措施和提供一定的实验依据。 方法: 1.用化学缺氧剂氯化钴(CoCl2)模拟PC12细胞化学性缺氧,应用重组人促血小板生成素建立抗CoCl2诱导的PC12细胞损伤的保护模型; 2.应用四甲基偶氮唑盐比色法(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,MTT)进行细胞毒性的判断,检查PC12细胞的存活率; 3.AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡; 4.细胞内活性氧(ROS)检测:活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit),利用荧光探针 DCFH-DA染色荧光显微镜检测细胞内氧自由基（Reactive Oxygen Species,ROS)的含量。 5.线粒体膜电位的检测:JC-1染色,荧光显微镜下观察细胞内红绿光的强度并摄片,利用软件计算出各视野红绿光的比值;流式细胞术检测细胞膜电位的变化; 6.利用SPSS13.0统计软件分析数据,数据用均数±标准误表示,检验水准P<0.05。 结果: 1.CoCl2抑制PC12细胞生长具有浓度依赖性:化学性缺氧模拟剂CoCl2可以明显抑制PC12细胞的生长,MTT比色法检测显示,CoCl2刺激浓度(200,400,600,800,1000μmol/L)分别作用PC12细胞24h后,细胞存活率显著降低,因此,在后续实验中以500μmol/L浓度的CoCl2作用24h作为化学性缺氧的模型。 2.TPO可促进 PC12细胞生长:MTT比色法检测显示,25-100ng/ml浓度范围内干预PC12细胞48h后促进PC12细胞生长且呈浓度依赖性,其中100ng/ml的TPO的保护作用最显著。根据实验结果,选取100ng/ml TPO作为本实验的保护浓度。TPO保护PC12对抗CoCl2诱导的细胞毒性作用,实验结果证明,经600μmol/L浓度CoCl2处理后的PC12加入100ng/ml浓度的TPO作用48小时可以有效抑制由PC12细胞的毒性作用。故在后续实验中采用100ng/ml的TPO作为保护浓度。 3.流式细胞术检测显示:500μmol/L的CoCl2引起的PC12细胞损伤再经100ng/ml TPO处理48h后,其凋亡数量有明显减少的趋势,与对照组比较有统计学意义。 4.TPO可以降低CoCl2诱导的细胞内 ROS生成:活性氧检测试剂盒结果显示,500μmol/L的CoCl2处理6小时后,细胞内ROS含量增加,而再经100ng/ml TPO干预12h后荧光强度明显减弱,但100ng/ml的TPO本身不会影响胞内ROS的生成,结果提示TPO可以抑制CoCl2诱导的细胞内ROS生成增多。 5.TPO可以抑制CoCl2引起的细胞内线粒体膜电位的降低:流式细胞术JC-1染色显示,500μmol/L的CoCl2处理24小时后,胞内线粒体膜电位显著降低,但经由100ng/ml TPO干预48h,可以明显抑制胞内线粒体膜电位的降低。表明,TPO可通过抑制线粒体膜电位的降低来保护细胞的缺氧损伤。 结论: 1.CoCl2模拟化学性缺氧引起PC12细胞损伤,使PC12细胞存活率降低,胞内活性氧生成增多以及细胞线粒体膜电位降低。 2.TPO可以对抗CoCl2造成的PC12细胞化学性损伤,抑制CoCl2引起的细胞毒性作用,减少胞内活性氧生成以及抑制细胞线粒体膜电位的降低。