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背景和目的:脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常见的神经肌肉疾病,由于脊髓α运动神经元缺失导致广泛性的骨骼肌萎缩,尤其是四肢和躯干。SMA是由运动神经元存活蛋白(survivor of motor neuron,SMN)表达减少引起的。SMA患者中,编码SMN蛋白的SMN1基因由于基因功能失活不能产生正常的SMN蛋白,其同源的SMN2基因也因为外显子7第6个碱基变化(C6T)仅表达有限的全长SMN蛋白。根据SMA病人临床的严重程度和发病的年龄,SMA分为四种类型,Ⅰ型是最严重的类型,Ⅱ型为中间型,Ⅲ型为温和型,Ⅳ型为成人型。SMN2基因的拷贝数是调控SMA严重程度的一个关键因素。一般情况下,大多数严重的Ⅰ型SMA病人携带1-2个SMN2拷贝;大多数中度的Ⅱ型SMA病人携带3个SMN2拷贝;而大多数温和的Ⅲ型SMA病人携带3-4个SMN2拷贝。然而,有很多病人SMN2的拷贝数并不与临床严重程度呈负相关。比如,携带3个拷贝SMN2基因的患者可以是Ⅰ型和Ⅲ型,还有极少数为Ⅰ和Ⅳ型。Thomas Prior等研究发现3例患者外显子7上的c.859G>C突变促进SMN2外显子7列入(exon inclusion),从而解释了为何这些患者仅携带2个SMN2拷贝却疾病轻微。近期,Thomas Prior医生又发现一组53位携带3个拷贝SMN2的患者,被诊断为SMA时皆已20余岁,显示Ⅲ或Ⅳ型的临床特征,通过基因组测序发现有5位患者的一个SMN2拷贝是从SMN1基因转变(gene convertion)而成,但转变仅发生于C6T,而其他部位仍和SMN1基因一致,这一等位基因(allele)相当于SMN1C6T。这种从SMN1到SMN2的基因转换没有在较严重的患者中发现,因此我们推测SMN1C6T的外显子7剪接可能得到了改善,导致SMN蛋白表达增加,从而缓解患者的病情。方法:基因测序分析SMA患者基因型;构建SMN1/2 minigene载体用于可变剪接验证;通过定点突变技术分析影响SMN1/2外显子7列入的关键置换;通过最小自由能与外显子7列入的相关性分析二级结构对SMN1/2剪接变化的影响;通过删除突变分析SMN1/2内含子6上影响剪接的顺式作用元件;通过RNA色谱分析与质谱鉴定揭示结合顺式作用元件的RNA结合蛋白;通过MS2靶向实验验证RNA结合蛋白对剪接的调控作用;通过对RNA结合蛋白结构域的分析解释其影响剪接的机制;过表达与敲低RNA结合蛋白验证其对SMN1/2基因可变剪接的调控作用。结果:SMN1 C6T的pre-mRNA外显子7剪接比SMN2更有效;SMN1/2上的G-44A突变会抑制全长mRNA、SMN蛋白的产生;G-44A位点附近是一个内含子剪接沉默子;HuR能结合到顺式作用元件上,G-44A突变会增加HuR的结合,从而抑制全长mRNA的产生;HuR的RRM1和RRM2结构域介导剪接抑制作用;过表达HuR抑制外显子7列入,敲低HuR促进外显子7列入;结论:我们发现了一种新的提高SMN蛋白水平、缓解SMA患者病情的新机制。A-44G的碱基变化显著降低了 HuR对SMN1/2内含子6上剪接沉默子的亲和力,从而造成了外显子7列入的适度增加。