论文部分内容阅读
研究目的:建立抗PLA2R抗体的超灵敏定量检测方法,改进抗PLA2R抗体检测在特发性膜性肾病、继发性膜性肾病乃至其他肾病中的应用。研究内容:(1)重组PLA2R的表达、纯化和鉴定。(2)抗PLA2R抗体的定量标准品的制备。(3)Eu3+标记抗人IgG抗体的制备。(4)建立抗PLA2R抗体时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测方法,并进行反应条件的优化选择和方法学的评估。(5)将此技术应用于膜性肾病的研究,是否可以准确的评估抗PLA2R抗体在特发性膜性肾病、继发性膜性肾病乃至其他肾病中的应用价值,是否可能通过不同的阈值对膜性肾病的程度和类型进行区分。研究方法:(1)采用带有flag标签的PLA2R质粒进行重组PLA2R的表达、用偶联有flag抗体的柱料进行纯化、鉴定重组PLA2R的分子量和免疫反应活性。(2)筛选出一个含高浓度抗PLA2R抗体的血清,采用尿素解离结合在PLA2R包被孔上的抗PLA2R抗体,并进行IgG抗体定量,推算出原血清中抗PLA2R抗体的浓度,将此已知抗PLA2R抗体浓度的样品稀释到不同浓度作为抗PLA2R抗体的标准品。(3)建立抗PLA2R抗体TRFIA检测方法,并从包被浓度的选择、标记抗体稀释度的选择、血清稀释度的选择、反应时间的选择等各方面进行了优化。从批内批间精密度、灵敏度、回收率、测量范围等方面对建立的TRFIA方法进行评价。(4)用建立的TRFIA试剂盒检测167肾病患者(其中特发性模性肾病77例,IgA肾病53例,红斑狼疮肾病16例,其它肾病21例)血清及286例健康体检者血清中PLA2R自身抗体浓度,进行参考范围的建立和诊断价值分析。创新性成果:(1)制备了具有特异性免疫反应活性的重组PLA2R抗原,可用于抗PLA2R抗体的检测。(2)制备了抗PLA2R抗体标准品,为抗PLA2R抗体检测的量化提供了依据。设置的抗PLA2R抗体的标准品浓度分别为0 μg/ml、0.17 μg/ml、0.68 μg/ml、3.42μg/ml、17.1 μg/ml、68.4μng/ml、343 μg/ml。(3)目前抗PLA2R抗体的血清学检测尚处于理论研究阶段,主要采用western-blot方法,少数研究者采用间接免疫荧光法和ELISA方法,但这些方法灵敏度有限,主要用于定性或半定量分析,而且操作复杂费时,另外目前还没有商品化的抗PLA2R抗体的定量检测试剂盒。本研究建立的TRFIA方法检测抗PLA2R抗体具有良好的检测性能,其灵敏度为0.02μg/ml,检测上限为343μg/ml,有效检测范围为0.02μg/mL～343 μg/ml,3份标本的回收率均值为98.96%,批内CV%(n=20)分别为6.38%、5.55%、4.88%,批间(n=8)CV%分别为7.69%、6.23%、6%,均<10%。本研究意义在于为膜性肾病患者提供一个除穿刺以外的可临床实际应用的血清学诊断指标,为该病的诊断、活动性的判断、治疗时机的把握、药物的选择及疗效判断提供一个理想的血清学标志物。使该病情的诊断和监控更为方便,患者容易接受,有利于特发性膜性肾病的早期诊断和治疗。(4)通过设定不同的阈值可以将正常人、IgA肾病、红斑狼疮肾病、IMN、其它肾病进行区分,0～0.91 μg/ml为正常参考值,35.8%的IgA肾病、50%的红斑狼疮肾病、14.3%其它肾病、88.3%的IMN的抗PLA2R抗体的值>0.91 μg/ml,IMN的检测特异性为90.9%;若以大于2.025 μg/ml为IMN的界定值(根据ROC曲线),非IMN肾病均阴性,77例IMN中57例为阳性,检测灵敏度为74%,特异性为100%。