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蛋白质内含子(intein)是前体蛋白质(precursor protein)中的一段氨基酸序列。intein两侧的氨基酸序列被称为蛋白质外显子(extein)。在前体蛋白质的翻译后成熟过程中intein从前体蛋白质中自我切除,两侧的蛋白质外显子以天然肽键的形式连接,这一成熟过程被称为蛋白质内含子介导的蛋白质剪接(intein-mediated protein splicing)。常见的intein按照其结构特征被分为三类：标准蛋白质内含子(canonical intein),微小蛋白质内含子(mini-intein)和断裂蛋白质内含子(split intein)。蛋白质剪接的分子机制包括剪接位点的N-S(N-O)酰基转化；分支中间物的形成；天冬酰胺残基的环化和自发的S-N(O-N)的酰基重排四步反应。C端外显子(C-extein)的第一个氨基酸残基较为保守,一般为Cys/Ser/Thr,普遍认为该氨基酸在intein自我剪接反应中起重要作用。它所发动的亲核进攻使N端内含子与外显子间发生断裂,由此推进剪接反应。因此,按C-extein首位氨基酸种类可将intein划分为Cys+1(C+1)、Ser+1(S+1)和Thr+1(T+1)型三类。然而应用于研究中的intein多为C+1和S+1型,它们仅在Cys和Ser前插入后行使功能,而在Thr前面插入时丧失原有剪接活性,这无疑限制了intein在蛋白质研究领域的应用范围。获得一类对C-extein首位氨基酸通用性高的split intein,使其得到广泛的应用具有重要意义。本课题的研究目的是获得具有高剪接活性的T+1型蛋白质内含子,并且通过定向进化提高其在异源宿主蛋白中剪接的通用性。本研究首先对四个均来自Trichodesmium erythraeum的天然蛋白质内含子,即：Ter DnaB-1、Ter RIR1-4、Ter Snf2和Ter Nds2进行改造,分别获得人工微小蛋白质内含子,并利用麦芽糖结合蛋白(meltose binding protein, MBP)和硫氧还蛋白(thioredoxin)组成的检测系统对上述蛋白质内含子在大肠杆菌中的剪接活性进行测试。结果表明在构建的五个人工型微小蛋白质内含子中,Ter RIR-4、Ter Snf2和Ter Ndse-2微小蛋白质内含子在大肠杆菌中均可发生蛋白质剪接,而Ter DnaB-1以及其两个不同的微小蛋白质内含子均没有剪接能力。将剪接活性较高的微小蛋白质内含子Ter Snf2进一步改造成为不同的断裂蛋白质内含子Ter Snf2 SO和Ter Snf2 S1,优化剪接条件,分别测试其在体内、体外的剪接能力。实验结果表明：诱导温度为25℃时,SO和S1在体内剪接效率均达到最高；结果也表明SO型蛋白质内含子在体外仍具有较高的剪接能力。为研究Ter Snf2的1位和+1位保守氨基酸对其剪接的影响,以便对其剪接机制有更加深入了解,进而为将其改造成为高效的蛋白质内含子工具提供有力依据,我们以Ter Snf2微小蛋白质内含子和断裂蛋白质内含子作为研究对象。研究结果表明：Snf-m 1位上Cys是剪接必不可少的,而+1位上的Thr则不是必需的,替换为Ser或Cys后Snf-m仍具有一定的剪接能力,实验结果与断裂水平结果完全吻合。说明该蛋白质内含子在不同氨基酸前插入时,具有一定插入位点的通用性。为了提高Ter Snf2 (T+1型)在异源蛋白质中剪接的通用性,构建了T+1型蛋白质内含子的kanaR定向进化筛选系统(directed evolution),并应用于TerSnf2微小蛋白质内含子的定向进化。利用易错PCR法(error-prone PCR)构建相应的突变库,借助卡那霉素抗性所建立的蛋白质剪接筛选系统进行快速有效的突变体筛选以及利用抗组氨酸标签抗体(anti-His antibody)进行Western印迹对蛋白质剪接活性进行检测。目前还没有获得阳性突变株,需要继续筛选。通过随机突变,加上功能选择,以其达到定向进化。通过这一研究策略,可获得高剪接活性的进化的蛋白质内含子,为进一步揭示蛋白质内含子的结构与剪接功能之间的关系带来新的启示,为推测蛋白质内含子的起源和进化提供更多的线索。