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花青素是植物中特有的次级代谢产物,与花色形成、抗逆、抗虫等有关,并在动物体内有抗癌、抗氧化等生理功能,因此开展花青素的生物合成调控研究不仅有助于加深对真核生物转录调控的认识,也有很广泛的应用价值。金鱼草是一种常见花卉,同时也是一种模式植物,广泛应用于转座子、花色、花型等领域的研究。但由于金鱼草遗传转化比较困难,已经严重阻碍了对金鱼草的深入研究。本文研究了金鱼草的毛状根诱导体系以及金鱼草毛状根中花青素合成的基因表达调控。
首先将pBI121质粒转入三种发根农杆菌(AR1193、R599、Aqua)构建了基因工程菌,以其感染三种不同遗传背景的金鱼草(JI7、JI98、SI),共得到了957条毛状根。通过GUS染色、PCR检测,发现不同遗传背景的金鱼草对不同农杆菌有着不同的敏感性:JI7对Aqua的侵染最敏感,生根效率最高,但是与AR1193相比,转化率相对低一些,因此在今后的转化实验中可以优先考虑AR1193;JI98对Aqua的侵染最敏感,生根效率和转化率都是最高的,在今后的转化实验中可以优先考虑Aqua;SI对三种菌的侵染都不太敏感,生根效率和转化率都很低,需要寻找新的农杆菌作为转化中介。
然后以毛状根作为外植体,研究了苗的再生。使用不同的激素组合,包括ZT、BA、NAA、TDZ等,处理了800个外植体,经过三个月的培养,最终获得了5株再生苗。由于毛状根获得再生苗的效率非常低,因此再生体系还需要继续探索。
金鱼草是研究花青素合成调控的模式植物之一,已经从金鱼草中分离出相关的花青素合成酶基因和多个转录因子。目前对花青素的前沿研究集中在转录调控领域。本文以金鱼草毛状根为研究对象,分析了ROSEA1、DELILA以及AtMYBL2三个基因在金鱼草毛状根中对花青素合成的调控作用。
使用发根农杆菌将ROSEA1转化JI7,获得了红色的毛状根。经过RT-PCR检测后,发现野生型JI7的根中不表达后期基因、ROSEA1和DELILA;过表达ROSEA1之后的CHS、DFR、ANS表达量明显升高,F3H和F3H略微升高;DELILA的表达不受ROSEA1调控;将DELILA转入到JI7的根中发现DELILA对CHS的表达有略微的上调作用,对其他基因没有明显的调控作用。
AtMYBL2是在拟南芥中发现的具有负调控作用的转录因子。本文克隆AtMYBL2、构建载体,并转化金鱼草,获得了过表达AtMYBL2的金鱼草毛状根,以此研究AtMYBL2在根中对花青素合成的调控作用。发现AtMYBL2在金鱼草毛状根中几乎对花青素合成没有影响。推测可能是由于拟南芥和金鱼草亲缘关系太远,导致AtMYBL2不能和金鱼草中的bHLH相互作用,从而不能抑制花青素合成。
与前人研究结果相比较发现ROSEA1和DELILA在根中和在花中的调控功能是有差别的(特别是对CHS的调控),说明同一基因在不同器官中的作用方式可能不同。转录因子与启动子的结合可作为下一步的研究方向,并推测在金鱼草中还有其他转录因子参与花青素的调控。
在论文的最后部分初步研究了ROSEA1在其他植物中的作用,包括拟南芥中过表达ROSEA1、烟草中过表达ROSAE1以及大豆毛状根的诱导。