谢氏宽漠王Mantichoru lasemenowi Reitter隶属于鞘翅目Coleoptera拟步甲科Tenebrionidae漠甲亚科Pimeliinae漠甲族Pimeliini宽漠王属Mantichorula Reitter。是分布在我国内蒙古阿拉善东部、宁夏中北部和蒙古国南缘的一个特有物种，其成虫能在沙表74℃的极端高温下活动并利用小生境繁衍生息，受环境胁迫形成了特殊的生理生态适应特征。了解谢氏宽漠王的热休克蛋白（heatshockprotein，HSP）基因调控，研究其在恶劣环境下的生物抗逆机制在理论和应用上都有重要的意义。　　 本论文以谢氏宽漠王为研究材料。研究内容主要分为3个部分：　　 第1部分：通过RT-PCR及RACE技术从谢氏宽漠王体内克隆获得与昆虫抗高温机制相关的2种不同hsp70基因的cDNA序列，并对其核苷酸和编码的蛋白序列进行了生物信息学分析；　　 第2部分：通过同源克隆得到谢氏宽漠王β-actin基因，检测了β-actin基因作为分子内标的可靠性，并建立了1种以在昆虫体内稳定表达的管家基因β-actin为分子内标的半定量RT-PCR方法。以此方法对热激条件下谢氏宽漠王体内Mshsp70、Mshsc70基因的mRNA表达水平进行相对定量研究；　　 第3部分：构建了谢氏宽漠王Mshsp70基因的原核表达载体，并在大肠杆菌DE3体内进行诱导表达，并以纯化后的蛋白免疫家兔制备抗体。　　 研究结果如下：　　 （1）谢氏宽漠王Mshsp70基因cDNA序列2137bp，编码区长1950bp，5'端非翻译区为19bp，3'端非翻译区为168bp。可编码649个氨基酸残基，理论分子量为71.34KD，同源性分析表明该基因与异色瓢虫Harmoniaaxyridis的核苷酸序列相似性高达85％，推导的氨基酸序列与赤拟谷盗Triboliumcastaneum蛋白序列相似性达92％。　　 （2）谢氏宽漠王Mshsc70基因cDNA序列1908bp，编码区长1808bp，3'UTR为100bp。编码601个氨基酸残基。理论分子量为57.85KD，同源性分析表明该基因的核苷酸序列和蛋白序列与赤拟谷盗的序列相似性分别为80％，85％。　　 （3）谢氏宽漠王β-actin基因cDNA序列全长1372bp，包含一个长度为1131bp的开放阅读框，编码376个氨基酸。5'和3'末端非翻译区域（UTR）分别为66bp和175bp；该数据与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96％～99％高度同源性。将该序列提交GenBank，获得序列号为EU825991。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化，且与未经热激处理的对照相比无显著差异，可以作为研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平高低的可靠内部参照标准。　　 （4）通过半定量RT-PCR分析：谢氏宽漠王在未经热处理的正常条件下，Mshsp70和Mshsc70均有表达，但是室温恢复过程中，2个基因具有截然不同的表达趋势。经42℃热激1h后立即诱导Mshsp70表达至最高峰；在恢复到室温的1～4h内Mshsp70表达量逐渐降低，但仍然高于未热激对照组。而Mshsc70在42℃热激1h后表达受到抑制，但在恢复2～4h内有少量的表达。　　 （5）利用高效原核表达载体pET-DsbA，成功构建了谢氏宽漠王Mshsp70基因的原核表达载体，并在大肠杆菌DE3中37℃培养，IPTG终浓度为1mM诱导3h获得成功表达。SDS-PAGE蛋白电泳显示，融合蛋白分子量约为60KD，目的条带与预期分子量一致。利用His亲和层析纯化得到融合蛋白，以纯化后的蛋白免疫家兔制备HSP70抗体，经过WesternBlot检测到与预期大小一致的特异性条带。