喉癌中S100A8基因调控机制研究前言喉癌是头颈部常见肿瘤之一,其发病率有逐年上升的趋势,越来越多资料支持炎症是肿瘤形成及进展的重要病因之一,我们的临床资料同样显示喉癌患者通常具有慢性炎症病史。在前期工作中,我室充分利用东北地区的病源优势,应用比较基因组杂交(CGH)和cDNA芯片结合RT-PCR、Western blot、免疫组织化学染色等实验技术证明炎症因子S100A8在转录和翻译水平上的表达存在显著地差异性,提示可能存在S100A8基因转录后调节的异常。microRNA是近年来发现的一类大小为18～23nt的小非编码转录后调节因子,由具有发夹结构、长约70～90个碱基的单链miRNA前体(pre-miRNA)经Dicer酶加工产生。通常,其在细胞质中与Argonaute等蛋白分子形成miRISC(miRNA induced silencing complex)。在miRNA的指引下,miRISC可以特异性地识别mRNA分子的3′端长约30个碱基的非编码区,并以完全或不完全匹配的方式与其结合,降解靶基因mRNA或抑制其翻译。由于存在这样不同类型的匹配方式,使得一种miRNA可以与多种mRNA分子结合。生物信息学等研究结果表明,人类有1/3以上的蛋白编码基因受miRNA调节。miRNA通过调节目的基因的蛋白表达,发挥着类似癌基因或肿瘤抑制基因的功能,如在生物体发育、信号转导、凋亡、细胞增殖等过程中起重要作用。另外,蛋白质相互作用在生命活动中扮演着关键角色,参与了生物学中的许多生理病理活动的调控,如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导和细胞代谢等,也是寻找下游靶基因的重要手段之一。我们前期通过RNA干扰实验等发现S100A8通过NF-Kappa B信号通路参与喉癌的发生和发展,且可能位于P65下游、BCL-2上游,但S100A8在该通路中的具体机制有待进一步研究。迄今为止,有关S100A8基因上游microRNA调控及参与NF-Kappa B信号通路的具体机制研究均未见报道。在本研究中,我们通过生物信息学资源结合荧光素酶活性分析探寻S100A8基因上游具有调控作用的microRNA分子;同时,通过喉癌中S100A8相互作用蛋白的研究,深入探讨S100A8基因在喉癌中的上下游调控机制,一方面可为阐明S100A8基因在喉癌发生和发展过程中的分子机制创造条件并提供新的线索,另一方面为开展以microRNA为靶点或通过蛋白相互作用设计竞争性抑制剂的喉癌诊断和治疗奠定基础。材料与方法利用生物信息学软件对S100A8基因3′非翻译区进行microRNA靶向预测,采用终点PCR和荧光定量PC R分别检测S100A8靶向microRNA在不同细胞系和喉癌组织中的表达情况。构建野生型及突变型S100A8基因荧光报告素酶表达载体,转染Hep2细胞,通过荧光定量PCR及Western blot检测分析靶向microRNA对S100A8基因的转录后调节作用。同时,通过倒置显微镜和Transwell小室法观察并检测共转染靶向microRNA及荧光报告素酶质粒前后喉癌细胞形态学和细胞体外侵袭能力的变化,综合分析靶向microRNA对Hep2生物学行为的影响。以喉癌Hep2细胞系为实验材料,应用免疫沉淀结合质谱技术筛查S100A8相互作用蛋白质并通过免疫共沉淀及细胞免疫荧光化学对相互作用蛋白质进行验证,通过RNA干扰技术进一步揭示相互作用蛋白质之间的调控关系。实验结果一、S100A8 mRNA靶micro RNA预测采用MiRanda和RNA22软件,我们在S100A8 mRNA第341bp碱基位置(3′非翻译区)预测到一个miR-24结合位点,其与大鼠的同源性高达95%。二、喉癌中miR-24表达采用U6-snRNA作为内对照,以GES-1细胞的表达水平作为基准,终点PCR及荧光定量PCR结果表明Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823和HEK293细胞系中miR-24表达均明显下调,ANOVA分析具有统计学意义(P＜0.05);同样,以癌旁正常组织为对照,10例喉癌组织中有7例样本(7/10,70%)存在miR-24的表达下调,双侧t检验分析具有统计学意义(P＜0.05)。三、miR-24对S100A8基因靶向调节测序结果表明,我们成功地构建了S100A8 3′LTR野生型和突变型荧光报告素酶表达载体。在Hep2和HEK293细胞中,共转染野生型S100A8表达质粒和miR-24前体组的报告基因活性相对于其它对照组明显降低,具有统计学意义(P＜0.05),而anti-miR-24能明显逆转这一效应。荧光定量PCR和Western blot结果表明,与对照组相比转染了miR-24前体和野生型报告质粒组的Hep2细胞中S100A8翻译水平显著降低(P＜0.05),而相应mRNA的表达水平无显著差异(P＞0.05)。四、miR-24对喉癌Hep2细胞体外侵袭能力的影响通过倒置显微镜观察发现共转染miR-24前体和野生型S100A8 3′UTR报告质粒能明显改变Hep2细胞的形态(变圆、减少),并能显著降低Hep2细胞的体外侵袭能力(P＜0.05)。五、喉癌Hep2细胞系中S100A8相互作用蛋白质筛查与鉴定通过免疫沉淀结合质谱技术,筛查并鉴定了四种与S100A8相互作用的蛋白质,分别为假想蛋白LOC80154、MHCⅠ类分子HLA-B、T-box 1异构体C类似物和SLAP1。免疫共沉淀和细胞免疫荧光化学结果进一步证实HLA-B与S100A8蛋白存在相互作用。六、HLA-B基因干扰效应的检测以β-actin作为内对照,RT-PCR结果显示在siRNA转染Hep2细胞第7天,HLA-B基因表达下调最为明显,与未转染及转染对照组相比具有显著性差异(P＜0.05),但后两组的干扰结果之间无显著性差异。七、HLA-B基因对喉癌Hep2细胞生物学行为的影响经流式细胞仪和Transwell小室法检测发现HLA-B RNA干扰组较对照组细胞凋亡率明显增加(P＜0.05),且Hep2细胞发生了明显的S期细胞周期阻滞。同时,干扰组细胞的增殖能力较对照组增强,跨膜细胞数也较对照组明显增多。ANOVA分析表明转染组与对照组差异显著,具有统计学意义(P＜0.05)。八、HLA-B基因对S100A8基因表达的影响以未转染及转染对照siRNA组为对照,用管家基因β-actin校正S100A8基因的表达水平。RT-PCR及Western blot结果表明,S100A8基因在三个实验组中均有表达,但在转染组表达明显下调,ANOVA分析具有统计学意义(P＜0.05)。结论(1)miR-24通过与炎症因子S100A8 3′UTR特定基序靶向结合负性调控该基因的表达。(2)miR-24能影响Hep2细胞的表型,并抑制其侵袭能力,这些作用可能通过抑制S100A8的表达实现的。(3)筛查并鉴定了喉癌中四种与S100A8相互作用的蛋白质,分别为:假想蛋白LOC80154、MHCⅠ类分子HLA-B、T-box 1异构体C类似物和SLAP1;(4)首次证实HLA-B异常表达与喉癌的生物学行为相关,且部分通过P65/HLA-B/S100A8/BCL-2/Caspase-9(-3)途径调控S100A8基因表达。