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血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是指由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的一种获得性智能损害综合征,是仅次于阿尔兹海默症之后的第二大常见痴呆类型。流行病学研究显示:随着人口老龄化的加剧,VD的发病率呈逐年上升趋势,这不仅严重影响了患者的生活质量,也给家庭和社会增添了沉重的负担。因此开发有效的防治血管性痴呆的药物已成为当前急需解决的医学和社会问题。桃红四物汤出自于清?吴谦所著的《医宗金鉴》,由四物汤加桃仁、红花衍化而成,具有养血活血、祛瘀生新之功效。药理学研究证实,其不仅具有抑制血小板聚集、改善微循环作用,而且具有抗氧化、增强免疫功能等多种功效。近年来,随着桃红四物汤的临床应用范围的不断扩大,其在保护脑缺血状态下神经损伤,防治血管性痴呆的药理作用也开始日益受到人们的重视,然而并未得到深入探究。本研究通过从整体动物水平和细胞水平探讨桃红四物汤对血管性痴呆的保护作用及可能的机制,为筛选、开发桃红四物汤抗VD提供实验依据。目的:建立血管性痴呆大鼠模型,检测桃红四物汤对血管性痴呆大鼠学习、记忆能力的影响,同时对其机制进行研究;体外培养PC12细胞,建立糖氧剥夺损伤模型(oxygen glucose deprivation,OGD),探讨桃红四物汤含药血清(S-TSD)对OGD损伤的PC12细胞的保护作用与分子机制。从动物和细胞两方面为桃红四物汤治疗血管性痴呆提供实验依据。方法:在体实验中,采用大脑中动脉阻塞再灌注法(middle cerebral artery occlusion reperfusion,MCAO/R)建立血管性痴呆大鼠模型,建模成功后将其随机分为:假手术组,模型组,桃红四物汤高剂量组(18 g·kg-1),桃红四物汤中剂量组(9 g·kg-1),桃红四物汤低剂量组(4.5 g·kg-1),尼莫地平组(Nimodipine,20 mg·kg-1),术后连续给药14d。采用水迷宫实验、跳台实验观察桃红四物汤对VD大鼠学习能力和记忆能力的影响;酶联免疫吸附法(ELISA)测定海马组织中乙酰胆碱酯酶(ACh E)、5-羟色胺(5-HT)、内皮素-1(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)及血清中6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)的含量。HE染色观察海马CA1区神经元形态学变化。腹主动脉取血检测血液流变学指标。免疫组化法测定各组大鼠脑微血管密度(CD34)的表达。免疫组化法、Western blot法检测海马组织中Bax、Bcl-2蛋白的表达变化。离体实验中,采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)联合低糖培养基建立体外糖氧剥夺的PC12细胞损伤模型,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞的活力,筛选出合适的造模浓度及大鼠血清浓度范围。分别给予不同浓度的TSD含药血清,以MTT法检测细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态学变化。以乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性指标,丙二醛(MDA)含量以及Hoechst33258染色考察TSD含药血清对PC12细胞抗氧化及凋亡能力的影响;Western blot法分析给药后细胞Caspase-3蛋白的表达。结果:体内实验:桃红四物汤对VD大鼠学习记忆能力的影响:Morris水迷宫定位航行实验中,与假手术组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.01);桃红四物汤高、中剂量治疗组与模型组相比逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05或P<0.01)。Morris水迷宫空间探索实验中,与假手术组相比,模型组大鼠90s内穿越平台次数明显减少(P<0.01),目标象限所占路程百分比明显缩短(P<0.05);与模型组相比,桃红四物汤高、中剂量治疗组大鼠目标象限所在的路程百分比明显延长(P<0.01或P<0.05),穿越平台次数虽有增多,但与模型组相比无显著统计学意义(P>0.05)。跳台试验中,与假手术组大鼠相比,模型组大鼠的潜伏期和错误次数虽无显著性差异(P>0.05),但均呈现增多的趋势;桃红四物汤高、低剂量组与模型组相比,反应时间和错误次数有降低的趋势;桃红四物汤高、中剂量组与模型组相比,基础错误次数有降低的趋势。与假手术组大鼠相比,模型组大鼠潜伏期虽无显著性差异(P>0.05),但呈现降低的趋势;桃红四物汤各剂量组与模型组相比,潜伏期有升高的趋势;与假手术组大鼠相比,模型组大鼠错误次数显著增高(P<0.05),桃红四物汤高剂量组错误次数少于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。大鼠海马CA1区脑组织HE染色:假手术组可见海马CA1区神经细胞排列整齐紧密,分布均匀,结构清晰,外形规则;模型组神经细胞胞浆浓缩,部分细胞体收缩成多角形,排列紊乱,稀疏,核固缩深染细胞多见,呈杆状或三角形,核仁不明显;桃红四物汤高、中治疗组神经元形态均得到明显的改善,锥体细胞仅有少量缺失,细胞形态基本趋于正常。桃红四物汤对VD大鼠血清中TXB2,6-Keto-PGF1α含量的影响:模型组大鼠血清6-keto-PGF1α含量较假手术组明显降低,具有统计学意义(P<0.01);经药物干预后,桃红四物汤高剂量组和尼莫地平组大鼠血清中6-keto-PGF1α含量明显升高,具有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠血清TXB2含量较假手术组升高,具有统计学意义(P<0.01);经用药干预后,高、中剂量治疗组和尼莫地平组大鼠血清中TXB2含量较模型组明显降低,具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)桃红四物汤对VD大鼠血液流变学的影响:与假手术组相比,模型组全血黏度高、中、低切、血浆黏度升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,桃红四物汤高、中剂量组可显著降低高、中、低三个切变率下的全血黏度,血浆粘度(P<0.05或P<0.01)。桃红四物汤低剂量组可显著降低VD大鼠的血浆粘度(P<0.05)。与假手术组相比,模型组大鼠海马中AChE活性、ET-1与VEGF的含量明显上升,具有显著性差异(P<0.01);桃红四物汤组高、中剂量组,尼莫地平组与模型组相比,大鼠海马组织中ACh E活性、ET-1与VEGF含量明显下降,有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。与假手术组相比,模型组大鼠海马中5-HT含量明显降低(P<0.01);与模型组比较,桃红四物汤各剂量组和尼莫地平组均明显升高海马组织中5-HT的含量(P<0.05或P<0.01)。桃红四物汤对海马CA1区脑微血管密度的影响:假手术组大鼠脑微血管表达较少;模型组与假手术组比较表达升高,差异有统计学意义(P<0.01);桃红四物汤高剂量组的微血管表达在模型组的基础上进一步增多,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。桃红四物汤对VD大鼠海马区Bax和Bcl-2蛋白表达的影响:免疫组化结果:假手术组大鼠海马CA1区可见少量Bcl-2、Bax阳性细胞表达;模型组海马CA1区Bcl-2、Bax阳性细胞染色加深,平均光密度值显著升高,与假手术组相比有显著性差异(P<0.01或P<0.05);而经药物治疗后,TSD各剂量组海马CA1区Bax平均光密度值与模型组比较均显著降低(P<0.01或P<0.05),TSD高、中剂量组海马CA1区Bcl-2平均光密度值与模型组比较均显著升高(P<0.01)。Western blot结果:与假手术组相比,模型组大鼠海马区Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bax蛋白表达水平显著增高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著下调(P<0.01);与模型组相比,桃红四物汤高、低剂量组可显著下调Bax蛋白表达(P<0.01),桃红四物汤高剂量组可显著上调Bcl-2蛋白表达(P<0.01),桃红四物汤高、低剂量组Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.01或P<0.05)。体外实验:OGD损伤PC12细胞条件的筛选:MTT法检测结果表明,Na2S2O4浓度为20m M时,联合低糖培养基作用PC12细胞24h生长抑制率接近50%,故选择该计量作为造模浓度。S-TSD对OGD诱导的PC12细胞形态的影响:倒置显微镜下形态学观察结果显示,模型组细胞密度降低,出现回缩变圆、折光性减弱、突触缩短;而10%含药血清组细胞形态贴壁细胞数目较多,脱落细胞数减少,细胞折光性增强,比较接近于正常组细胞。S-TSD对OGD损伤的PC12细胞活力的影响:MTT法检测结果显示,空白大鼠血清在5%~15%的范围内时,细胞活力随浓度升高而逐渐增高;与模型组比较,5%、10%、15%浓度的桃红四物汤含药血清对OGD损伤的PC12细胞均表现出一定程度的保护作用。S-TSD对OGD诱导的PC12细胞培养上清液中LDH活性的影响:与正常对照组细胞相比,OGD作用后LDH漏出显著增加(P<0.01),而5%、10%桃红四物汤含药血清预处理之后,与同浓度模型组相比LDH漏出显著降低(P<0.05)。S-TSD对PC12细胞OGD损伤后MDA含量、SOD活性的影响:ELISA检测结果发现,与同浓度模型组相比10%、15%的桃红四物汤含药血清可显著提高细胞内SOD活力、降低MDA含量。Hoechst33258荧光染色:Hoechst33258荧光染色结果显示,OGD模型组细胞,多数细胞核呈现蓝白色、碎块状致密浓染,呈现典型的凋亡细胞核特征;而10%桃红四物汤含药血清处理后呈现凋亡特征的细胞数量减少。S-TSD对OGD诱导的PC12细胞Caspase-3表达的影响:Western blot检测结果发现,与空白血清组相比,OGD损伤组Caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.01);与OGD损伤组相比,10%含药血清能够明显降低Caspase-3的蛋白表达(P<0.05)说明其保护作用与抗OGD诱导的细胞凋亡相关。结论:(1)桃红四物汤能明显改善血管性痴呆大鼠的学习、记忆能力,其机制可能与改善神经递质,扩张脑血管,促进脑部血管新生,改善血流状态,抗凋亡相关。(2)桃红四物汤含药血清在一定浓度范围内对OGD诱导PC12细胞的损伤具有明显的保护作用,其保护作用可能降低氧化损伤的发生,增强其抗凋亡能力相关。