论文部分内容阅读
目的 近年来,乳腺癌的发病率呈上升趋势,发病率居于女性恶性肿瘤的首位,对世界女性健康造成严重威胁。血管新生过程是肿瘤的增殖、侵袭、转移的关键环节,抗血管新生治疗也广泛应用于临床,抗血管生成药物日新月异。Y盒结合蛋-1(Y-box binding protein-1,YB-1)作为体内重要的转录因子,在包括基因转录、RNA剪切及m RNA翻译、DNA修复、细胞增殖等多个过程中均发挥重要作用,并在肺癌、结肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表达,并与肿瘤增殖、耐药密切相关,且有研究表明其可调节血管内皮细胞的增殖,但其调节肿瘤血管新生的机制有待进一步研究。本研究通过构建腺病毒表达载体,并用腺病毒液感染EA.hy926内皮细胞旨在探究冷休克蛋白家族成员YB-1蛋白C末端结构域(YB-1 C-terminal domain,YB-1 CTD)对血管新生的调节机制,为抗血管新生靶向治疗提供理论依据。方法 构建腺病毒表达载体,用GFP和GFP-YB-1 CTD腺病毒液感染EA.hy926内皮细胞,MTS法检测GFP和GFP-YB-1 CTD对细胞增殖的影响;流式细胞术PI染色检测YB-1 CTD对细胞周期的影响;Western blot检测YB-1 CTD对EA.hy926细胞周期相关蛋白p21、cyclin B1的表达水平的调节;RT-PCR检测YB-1 CTD对p21、cyclin B1m RNA表达的影响;跨膜迁移实验评价YB-1 CTD对EA.hy926内皮细胞迁移能力的影响;血管内皮成环实验检测YB-1 CTD对EA.hy926内皮细胞血管成环特性的影响;ELISA检测YB-1CTD对SK-BR-3乳腺癌细胞分泌VEGF的调节;检测细胞骨架染色观察YB-1CTD对EA.hy926内皮细胞细胞骨架的分布及状态的影响。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS16.0统计软件进行处理,均数比较采用t检验或单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果 MTS法检测细胞增殖显示,转染GFP-YB-1 CTD 48小时后,EA.hy926内皮细胞和SK-BR-3乳腺癌细胞增殖均受到抑制;流式细胞术PI染色检测细胞周期结果提示YB-1 CTD可调节EA.hy926细胞周期阻滞在G1期;Western blot免疫印迹分析显示与GFP对照组相比,GFP-YB-1 CTD能上调EA.hy926内皮细胞中p21蛋白的表达水平,并下调cyclin B1蛋白的表达水平;实时定量PCR结果提示,在m RNA水平,YB-1CTD促进p21的表达,而抑制cyclin B1的表达;跨膜迁移实验可见GFP组较GFP-YB-1 CTD组跨膜迁移的细胞数多;鬼笔环肽细胞骨架染色观察到GFP组EA.hy926内皮细胞中含有大量平行束状分布的应力纤维,且纤维粗大,沿细胞长轴分布,GFP-YB-1 CTD组,未见明显的纤维束,微丝解聚并且弥散地分布于胞质中,血管内皮成环实验结果显示,在40倍显微镜下,GFP组血管内皮成环数量多,血管环完整,在Metrigel胶表面较均匀分布,延长培养时间血管环稳定,不易破碎,GFP-YB-1 CTD组内皮细胞不易成环,或者部分成环,血管环不完整,成条索状结构;在100倍显微镜下观察GFP组能明显观察到EA.hy926血管内皮细胞伸展、延长,相邻的细胞可以连接呈环状。GFP-YB-1 CTD组EA.hy926血管内皮细胞部分伸展,部分呈球状,仅有少数细胞可以产生相互连接,形成类似于“肝索”样的细胞条索,而不是完整的血管环。ELISA法检测SK-BR-3细胞条件培养基中的VEGF含量结果显示,与GFP对照组相比,GFP-YB-1 CTD组条件培养基中VEGF含量低。SK-BR-3细胞条件培养基刺激条件下的血管成环结果显示,GFP组血管内皮成环数量多、血管环完整、周长较长,延长培养时间,血管环稳定,GFP-YB-1 CTD组内皮几乎不成环或者少数成环,成环局限、不完整且不稳定易破碎。结论 YB-1 CTD抑制EA.hy926内皮细胞及SK-BR-3乳腺癌细胞增殖,影响EA.hy926迁移和成环能力,同时抑制SK-BR-3乳腺癌细胞分泌VEGF以及SK-BR-3细胞条件培养基刺激条件下的血管生成。