论文部分内容阅读
第一章脂肪间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的探讨脂肪间充质干细胞的分离、培养方法，观察其生长增殖情况，鉴定其生物性特征。方法以S-D大鼠为研究对象，机械分离，胶原酶消化腹股沟和附睾脂肪组织，获取细胞培养于含新生牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM培养基中，利用干细胞的附壁生长特性，通过更换培养基而不断纯化获取脂肪间充质干细胞，镜下观察细胞形态变化。MTT法测定传3、5和10代细胞增殖情况。流式细胞仪检测传5代细胞表面CD29、CD34和CD44表达情况。结果原代培养后24小时看见微少贴壁细胞，初起为小圆形，48小时后可见梭形、短梭形和多角形贴壁细胞，3天后成纤维样细胞明显增多，5天左右进入对数增长期，8天左右细胞单层融合接近90％。传代细胞于2小时即可完成贴壁，生长较快，多数为成纤维样细胞，6天左右细胞单层融合。传3代后细胞形态均一。10代以后细胞则逐渐有宽大梭形样变。生长曲线显示传3、5代脂肪间充质干细胞均有较强的增殖能力，其中传5代细胞更为明显，而传10代细胞的增殖能力逐渐减弱。流式细胞仪检测传5代细胞有95％表达CD44，96％表达CD29，而只有5％表达CD34。结论大鼠脂肪间充质干细胞分离提取操作简便易行，且有较强的生长增殖能力，能够长期培养，符合组织工程种子细胞的基本条件。第二章脂肪间充质干细胞体外诱导成软骨能力的实验研究目的探讨脂肪间充质干细胞在特定培养基条件下体外定向软骨细胞分化的能力。方法（1）如前述方法，分离培养大鼠脂肪间充质干细胞。（2）取传5代细胞采用初始细胞密度为1.0×1010／L的“微团”培养方法在特定培养基条件下进行成软骨诱导，诱导培养基为高糖DMEM，含体积分数为0.01的新生牛血清、10ug／L的转化生长因子β1、6.25mg／L的转铁蛋白、1×10-7mol／L的地塞米松和50mg／L的维生素C。（3）观察脂肪间充质干细胞在诱导后的生长增殖情况、形态变化，于诱导7、14天后应用阿尔新兰染色、甲苯胺兰染色、藩红0／固绿染色，以及4、7、14天后应用Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学、aggrecan免疫荧光评价其成软骨能力。（4）逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测脂肪间充质干细胞诱导0周、2周和4周后前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA表达情况。（5）蛋白印迹试验（Western-blot）检测脂肪间充质干细胞诱导0周、2周和4周后前Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan的蛋白表达。结果（1）在特定培养基诱导条件下，脂肪间充质干细胞细胞生长增殖明显减缓，细胞形态由梭型渐变为三角形、多角形、圆形，有自发聚集倾向，高密度的“微团”培养细胞在诱导后48小时可以聚集形成结节，并逐渐增大，12天左右结节呈半透明类软骨样外观。（2）脂肪间充质干细胞在高密度的“微团”培养条件下，于诱导7、14天后阿尔新兰染色、甲苯胺兰染色、藩红0／固绿染色阳性，诱导4、7、14天后Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学、aggrecan免疫荧光阳性表达。（3）RT-PCR检测高密度“微团”培养的脂肪间充质干细胞诱导0周前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA呈阴性表达，而在诱导后2周和4周呈阳性稳定表达。（4） Western-blot检测在脂肪间充质干细胞诱导后0周前Ⅱ型胶原、aggrecan的蛋白为微弱表达，而在诱导2周和4周后呈阳性稳定表达。结论在体外特定的诱导环境下，高密度微团培养的脂肪间充质干细胞可以向软骨细胞方向分化，并能够稳定表达软骨细胞特异表型。第三章脂肪间充质干细胞复合PLGA体外培养诱导成软骨的实验研究目的探讨脂肪间充质干细胞在PLGA支架上培养并定向软骨方向诱导分化的能力，以及PLGA支架作为脂肪间充质干细胞载体的可行性。方法（1）将PLGA柱状支架，分别经过乙醇消毒、紫外线照射灭菌处理，晾干备用。（2）如前述方法，分离培养大鼠脂肪间充质干细胞，取传5代细胞，以4.0×1010／L的初始细胞密度接种在PLGA支架材料上，分诱导组和未诱导组，诱导组在特定培养基，即含体积分数为0.01的新生牛血清、10ug／L的转化生长因子β1、6.25mg／L的转铁蛋白、1×10-7mol／L的地塞米松和50mg／L的维生素C的高糖DMEM条件下进行成软骨诱导。（3）于3周后取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖情况，取材石蜡包埋切片行H-E染色、藩红0／固绿染色和Masson三色染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光评价脂肪间充质干细胞在PLGA材料内部的生长情况和成软骨能力。（4）应用RT-PCR检测脂肪间充质干细胞／PLGA支架复合培养3周后未诱导组和诱导组前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA的表达情况。结果（1）脂肪间充质干细胞接种在PLGA材料复合培养时，初起细胞／材料复合体悬浮于培养基中，2天后渐沉入培养基底部，诱导组复合体表面逐渐光滑润泽，质地逐步增韧，倒置显微镜下可见有少量细胞溢出支架材料并附壁生长。（2）诱导组3周后扫描电镜观察，见细胞在支架表面分布密集，并可见支架空隙细胞延伸，基质分泌旺盛，甚至连接成片；未诱导组基质分泌较少。（3）石蜡切片H-E染色可见细胞在支架内部生长，但数量明显少于支架外部；石蜡切片见诱导组藩红0／固绿染色和Masson三色染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光呈阳性表达，可见少量成熟软骨陷窝形成，未诱导组呈阴性。（4）在脂肪间充质干细胞／PLGA支架复合培养3周后，RT-PCR检测诱导组前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA均呈阳定表达，未诱导组呈阴性。结论脂肪间充质干细胞可以和PLGA支架复合培养，在特定的诱导培养基条件下可以表达软骨特异表型，形成类软骨样组织。第四章脂肪间充质干细胞复合PLGA体内异位成软骨的实验研究目的探讨脂肪间充质干细胞／PLGA材料复合体体外诱导后植入裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的能力。方法（1）如第三章所述方法，脂肪间充质干细胞复合PLGA体外培养或诱导3周。（2）分别将诱导组和未诱导组细胞／支架复合体植入裸鼠背部皮下两侧，观察裸鼠的生活力变化以及皮下种植的细胞／支架复合体质地和形态变化。（3）分别于8周和12周取材石蜡包埋切片行H-E染色、阿尔新兰染色、藩红0／固绿染色和Masson三色染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光评价脂肪间充质干细胞复合PLGA异位成软骨能力。（4） RT-PCR检测体内细胞材料复合体在8周和12周时前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA的表达情况。结果（1）将经过体培养的细胞／PLGA材料复合体植入裸鼠皮下后，裸鼠成长良好，没有全身和局部的炎症和毒性反应，诱导组细胞／支架复合体的大小形态基本保持原状，质地逐步增韧；未诱导组细胞／支架复合在8周取材时已无明确形体残留。（2）在8和12周后诱导组取材，石蜡包埋切片，行阿尔新兰染色、藩红0／固绿染色和Masson三色染色，以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光均可见成熟软骨陷窝生成，胞外基质蛋白聚糖、粘蛋白、胶原纤维异染阳性表达，软骨特异表型Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan强表达。（3）在诱导组细胞材料复合体体内植入8周和12周时，应用RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA均呈阳性稳定表达。结论脂肪间充质干细胞复合PLGA材料经体外诱导后具有在裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的能力。