耳聋是全球性重大公共卫生问题,由毛细胞功能障碍引起的感音神经性耳聋是最常见的一种。内耳毛细胞是一种终末分化细胞,可以作为一种感受器将声音刺激转化为电信号而传入大脑。毛细胞很容易受到噪音、年龄和氨基糖苷类耳毒性药物的影响而被损坏。哺乳动物中毛细胞的丢失是不可再生的,从而导致永久性的听力损伤。近十年来,干细胞治疗技术兴起为众多人类重大疾病的治疗带来了新的革命。干细胞具有全能或多能性以及高度的自我增殖能力,其干性维持及分化是组织发育和再生修复的驱动力。利用干细胞相关技术,将使听觉系统损伤修复特别是受损毛细胞的再生和修复成为可能,有望从根本上治疗耳聋这一顽疾。内耳干细胞是内耳毛细胞重生的重要种子细胞,可能存在于内耳前庭椭圆囊和球囊、耳蜗基底膜以及半规管壶腹脊等区域。研究证明内耳干细胞可以自我更新并具有多分化潜能,在合适的诱导条件下可以分化为毛细胞。但是在内耳干细胞及毛细胞的相关研究中依旧存在很多问题。主要包括：1、内耳干细胞数目十分有限,其在内耳中的具体分布还不是特别清楚,体外培养条件复杂、培养难度大。2、内耳干细胞体外诱导分化为毛细胞的分子机制还还不甚明了,分化产生的毛细胞不具有典型的毛细胞特性,没有功能。3、缺乏特异性分子标志对内耳干细胞、祖细胞和毛细胞进行鉴定和分选。因此,本研究的前两部分内容(即第二章和第三章)主要研究内耳干细胞的体外分离、培养、鉴定以及如何在体外将内耳干细胞诱导分化为具有典型静纤毛和电生理反应的成熟毛细胞。最后一个部分,主要研究了内耳干细胞分化为毛细胞这一过程中基因的表达情况,并筛选出了干细胞、祖细胞和毛细胞的特异性分子标志。第一部分：主要研究了新生PO天ICR小鼠耳蜗基底膜上内耳干细胞的分离及培养方法,并将培养得到的内耳干细胞进行了一系列的干细胞、祖细胞及发育相关标志基因的检测。实验结果表明耳蜗基底膜上的细胞形成的细胞球表达内耳干细胞和祖细胞的标志基因,说明培养得到的确实为内耳干细胞,但是有部分细胞已经发育到祖细胞阶段。Brdu检测显示细胞球中的绝大部分细胞为阳性,表明绝大部分细胞为增殖产生。免疫细胞化学检测同样显示细胞球中的细胞表达Nestin蛋白。第二部分：为了进一步将分离得到的内耳干细胞诱导分化为具有功能的毛细胞。我们将内耳干细胞接种在经多聚赖氨酸处理过的培养板中,贴壁诱导分化。选取内耳干细胞、干细胞体外分化7天以及分化14天这三个时间点的细胞进行基因和蛋白检测。结果表明内耳干细胞标志基因在分化过程中表达下调,内耳发育相关基因在分化过程中保持表达,而内耳毛细胞标志基因在分化过程中表达上调。免疫荧光检测表明,分化14天之后,部分细胞表达毛细胞特异蛋白MyosinVIIA、Bm3c以及Espin。扫描电镜检测显示,内耳干细胞表面没有静纤毛,而诱导分化之后部分细胞存在杂乱的静纤毛。说明部分内耳干细胞分化成不成熟的毛细胞。为了在体外诱导得到成熟的毛细胞,我们采用两步诱导法来将内耳干细胞诱导成功能性毛细胞。首先,我们将内耳干细胞接种在多聚赖氨酸预处理过的培养皿上,将内耳干细胞诱导为内耳祖细胞。然后,我们将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊基质细胞上诱导分化。结果表明生成的毛细胞表面存在成束的规则排列的静纤毛,具有F-actin丰富的凸起并且表达动纤毛标志Tubulin。这些毛细胞可以吸收FM-143,并经膜片钳检测证明具有电生理功能。这提示我们,在理想的培养条件下,内耳干细胞在体外可以诱导分化为具有功能的成熟毛细胞。第三部分：内耳毛细胞的发育过程受到一系列的转录因子以及信号通路的调控,鉴定和调控内耳毛细胞发育过程中的关键基因有助于控制毛细胞的分化。我们选取内耳干细胞、内耳干细胞分化7天形成的祖细胞以及分化14天形成的毛细胞这三个不同发育阶段的细胞为研究对象。毛细胞通过FM1-43特异标志后经流式分选得到。提取出这3种细胞的RNA进行Phalanx小鼠基因表达谱芯片的检测,检测出不同基因在这三个阶段的表达情况。我们在内耳干细胞、祖细胞和毛细胞中分别筛选出30、38和31个特异表达的基因,并在小鼠不同组织中进行了特异性检测。最后确定Gdf10+Ccdc121组合可以作为干细胞特异性标志基因；Tmprss9+Orml组合为祖细胞特异性标志基因；Chrna9+Espnl组合为毛细胞特异性标志基因。本研究的主要目的是发现新的毛细胞及其前体细胞(包括干细胞与祖细胞)的分子标志,为内耳干细胞的准确鉴定及快速无损的分选提供了条件和依据。