[研究目的]从细胞及分子水平,探讨中药单体槲皮素、水蛭素、桂皮醛及其复方对高糖条件培养大鼠脊髓背根神经节细胞氧化应激及细胞凋亡的影响。[研究方法]1.从孕15天的SD胎鼠取材制备脊髓背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron, DRGn),采用胰蛋白酶消化法、Neurobasal无血清神经元专用培养基+B27添加剂+神经生长因子(nerve growth factor, NGF)培养基原代培养,经密度梯度离心法、差速贴壁法及有丝分裂抑制剂进行细胞纯化,抗MAP-2抗体进行细胞鉴定。2.通过MTT法摸索槲皮素(Q)、水蛭素(H)及桂皮醛(C)减少高糖条件下DRGn细胞凋亡的最适浓度及干预时间点。依据各单体高(Q3、H3、C3)、中(Q2、C2、H2)、低(Q1、H1、C1)剂量,分别按照两两组合、三三组合的方式进行组合,摸索最优组合：槲皮素+水蛭素(QH)组合、槲皮素+桂皮醛(QC)组合、桂皮醛+水蛭素(CH)组合及槲皮素+水蛭素+桂皮醛(QCH)组合。3.采用流式细胞技术检测各组DRGn细胞的活性氧水平、Western Blot和qRT-PCR法检测(?)Nrf-2、HO-1、NF-κB (P65)、IκB-α、pIκB-α IL-6、TNF-α及Caspase-3蛋白及mRNA表达,TUNEL法检测细胞凋亡。[研究结果]一、中药单体Q、H及C可抑制高糖(45mmol/L)对体外DRGn细胞的损伤：1.中药单体Q、H及C可抑制高糖条件下DRGn细胞活性的下降：高糖(HG)组DRGn细胞活性与正常对照(CON)组比较下降(P<0.01)。在高糖条件下,不同剂量Q、H及C组细胞活性与CON组比较均下降(P<0.01)但与HG组比较均升高(P<0.01或P<0.05)；与阳性对照药α-硫辛酸(ALA)组比较均减低(P<0.01或P<0.05)；不同剂量Q、H及C抑制高糖条件下DRGn细胞活性下降的作用具有量效依赖性。2.中药单体Q、H及C可减少高糖条件下DRGn细胞凋亡及凋亡相关指标的升高：HG组细胞的细胞凋亡率及活化的Caspase-3蛋白、Caspase-3mRNA表达与CON组比较均升高(P<0.01)。在高糖条件下,不同剂量Q、H及C组细胞的细胞凋亡率及活化的Caspase-3蛋白、Caspase-3mRNA表达与CON组比较均升高(P<0.01),但与HG组比较均降低(P<0.01或P<0.05)；与ALA组比较均升高(P<0.01或P<0.05)；不同剂量Q、H及C减少高糖条件下DRGn凋亡及凋亡相关指标的作用具有量效依赖性。3.中药单体Q、H及C可抑制高糖条件下DRGn细胞活性氧水平的升高：HG组细胞活性氧水平与CON组比较升高(P<0.01)。在高糖条件下,不同剂量Q、H及C组活性氧水平与CON组比较均升高(P<0.01)；但与HG组比较均降低(P<0.01)；与ALA组比较均升高(P<0.01)；不同剂量Q、H及C清除活性氧的作用具有量效依赖性。4.中药单体Q、C及H高剂量组(H3)可抑制高糖条件下DRGn细胞炎性通路NF-κB/IL-6、TNF-a的激活：HG组细(?)(?)NF-κB (P65)、IκB-α、pIκB-α IL-6及TNF-a表达与CON组比较均升高(P<0.01)。在高糖条件下,不同剂量Q、H及C组的NF-κB (P65)、IκB-α、 pIκB-α IL-6及TNF-a表达与CON组比较均升高(P<0.01或P<0.05)；但不同剂量的Q、C组及H3组与HG组比较降低(P<0.01或P<0.05)；Q3、C3组与ALA组比较降低(P<0.01或P<0.05)；不同剂量Q及C抑制NF-κB(P65)、IκB-α、pIκB-α IL-6及TNF-a表达的作用具有量效依赖性。5.中药单体Q及H可激活自身抗氧化应激通路Nrf-2/HO-1：HG组细胞Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表达与CON组比较均降低(P<0.01)在高糖条件下,不同剂量Q、H组Nrf-2表达较CON、HG组升高(P<0.01)；与ALA组比较均降低(P<0.01或P<0.05)。HO-1表达与CON组比较均降低(P<0.01),与HG组比较均升高(P<0.01或P<0.05)；与ALA组比较均减低(P<0.01或P<0.05),不同剂量Q、H上调Nrf-2及HO-1表达的作用具有量效依赖性。C未见对该通路有激活作用。二、槲皮素、水蛭素及桂皮醛单体组合可增强单体抑制高糖损伤DRGn细胞的作用1.中药单体组合可增强中药单体抑制高糖条件下DRGn细胞活性下降的作用：在高糖条件下,单体及单体组合组的细胞活性与CON组比较均降低(P<0.01或P<0.05),与HG组比较均升高(P<0.01)；与ALA组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组细胞活性降低(P<0.01或P<0.05),QCH组与ALA组无差异；与QCH组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组均降低(P<0.01)；单体及两两组合间比较无差异。2.中药单体组合可增强中药单体减少高糖条件下DRGn细胞凋亡及凋亡相关指标升高的作用：在高糖条件下,单体及单体组合组的细胞凋亡率及活化的Caspase-3蛋白、Caspase-3mRNA表达与CON组比较均升高(P<0.01或P<0.05),与HG组比较均降低(P<0.01)；与ALA组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组均升高(P<0.01或P<0.05),QCH组与ALA组无差异；与QCH组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组均升高(P<0.01或P<0.05)；单体组间比较,Q3组较H3、C3组降低(P<0.01或P<0.05),H3组较C3组降低(P<0.01或P<0.05)；两两组合间比较,细胞凋亡率方面无差异,活化的Caspase-3蛋白及Caspase-3mRNA表达方面QH、CH组较QC组降低(P<0.01),QH组较CH组降低(P<0.01)；单体与两两组合间比较,Q3组较QH组升高(P<0.01或P<0.05),与QC、CH组无差异,H3、C3组均较QH、QC、CH组升高(P<0.01或P<0.05)。3.中药单体组合可增强中药单体抑制高糖条件下DRGn细胞活性氧水平升高的作用：在高糖条件下,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组的活性氧水平与CON组比较升高(P<0.01),QCH组与CON组无差异；各干预组与HG组比较均降低(P<0.01)；与ALA组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组升高(P<0.01),QCH组与ALA组无差异；与QCH组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组均升高(P<0.01)。单体组间比较,Q3较H3、C3降低(P<0.01或P<0.05),H3较C3降低(P<0.05)；两两组合间比较无差异；单体与两两组合间比较,Q3组与QH、QC及CH组无差异,H3组较QH组升高(P<0.05),与QC及CH组无差异,C3组较QH、QC组升高(P<0.01或P<0.05),与CH组无差异。4.中药单体组合可增强中药单体抑制高糖条件下DRGn细胞NF-κB通路激活的作用：(1) NF-κB (P65)、IκB-α、pIκB-α蛋白及NF-κB mRNA表达：在高糖条件下,单体及单体组合组的NF-κB(P65)、IκB-α、pIκB-α蛋白及NF-κBmRNA表达与CON组比较均升高(P<0.01或P<0.05)；与HG组比较均降低(P<0.01或P<0.05)；与ALA组比较,Q3、C3、QC、CH及QCH组均降低(P<0.01或P<0.05),H3组的NF-κB、pIκB-α蛋白表达及NF-κBmRNA表达与ALA组无差异,IκB-α蛋白表达升高(P<0.05),QH组NF-κB蛋白及mRNA较ALA组表达降低(P<0.01),IκB-α及pIκB-α蛋白表达无差异；与QCH组比较,Q3、H3、QH及CH组升高(P<0.01或P<0.05),C3及QC(?)iNF-κB表达与QCH组无差异,IκB-α及pIκB-α蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05)。单体组间比较：C3组NF-κB表达及pIκB-α蛋白表达较Q3、H3组降低(P<0.01或P<0.05),IκB-α蛋白表达较H3组降低(P<0.01),与Q3组无差异；Q3组的NF-κB表达及IκB-α、pIκB-α蛋白表达较H3组降低(P<0.01)。两两组合间比较：QC组与QH组比较,NF-κB表达及IκB-α、pIκB-α蛋白表达均降低(P<0.01)；QC组与CH组比较,NF-κB表达及pIκB-α蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05),IκB-α蛋白表达无差异；CH组与QH组比较,IκB-α、pIκB-α蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05),NF-κB表达无差异。单体与两两组合间比较：Q3组与QH组NF-κB表达及IκB-α、pIκB-α蛋白表达无差异；与QC组比较,NF-κB表达无差异,IκB-α及pIκB-α蛋白升高(P<0.05)；与CH组比较,NF-κB表达及pIκB-α蛋白表达无差异,IκB-α蛋白表达升高(P<0.05)；②H3组与QH、QC、CH组NF-κB表达及IκB-α、pIκB-α蛋白均升高(P<0.01)；③C3组与QH组比较,NF-κB表达及IκB-α蛋白表达降低(P<0.01),pIκB-α蛋白表达无差异；与QC组比较,NF-κB表达及IκB-α蛋白表达无差异,pIκB-α蛋白表达升高(P<0.01)；与CH组比较无差异。(2)IL-6和TNF-α蛋白及mRNA的表达：在高糖条件下,单体及单体组合组的IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表达与CON组比较均升高(P<0.01或P<0.05)；与HG组比较均降低(P<0.01或P<0.05)；与ALA组比较,Q3、C3、QH、QC、CH及QCH组降低(P<0.01或P<0.05),H3组IL-6蛋白表达升高(P<0.05), IL-6mRNA及TNF-α表达无差异；与QCH组比较：Q3、C3、QH及CH组IL-6表达及TNF-α蛋白表达均升高(P<0.01或P<0.05), TNF-α mRNA表达无差异,H3组IL-6和TNF-α蛋白及mRNA表达均升高(P<0.01或P<0.05),QC组IL-6mRNA及TNF-α蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05),IL-6蛋白及TNF-α mRNA表达无差异。单体组间比较,Q3、C3较H3组降低(P<0.01或P<0.05),C3与Q3组比较,IL-6蛋白表达减低(P<0.01),IL-6mRNA及TNF-α表达无差异；两两组合间比较无差异；单体与与两两组合间比较,Q3组IL-6蛋白表达较QH、QC、CH组升高(P<0.01),IL-6mRNA及TNF-a表达无差异；C3组与QH、QC及CH组无差异,H3组较QH、QC、CH组升高(P<0.01)。5.中药单体组合可增强中药单体对Nrf-2/HO-1通路激活的作用：在高糖条件下,Q3、H3、QH、QC、CH及QCH的Nrf-2蛋白及mRNA与CON组比较均升高(P<0.01),HO-1蛋白及mRNA与CON组比较均降低(P<0.01或P<0.05),C3组Nrf-2及HO-1表达均降低(P<0.01或P<0.05)；Q3、H3、QH、QC、CH及QCH的Nrf-2及HO-1表达与HG组比较均升高,C3组无差异；与ALA组比较,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组均降低(P<0.01或P<0.05),QCH组Nrf-2表达较ALA组无差异,HO-1表达升高(P<0.05)；与QCH组相比,Q3、H3、C3、QH、QC及CH组均降低(P<0.01或P<0.05)。单体组间比较,Q3、H3组较C3组升高(P<0.01),Q3较H3组升高(P<0.01)；两两组合间比较,QH组的Nrf-2及H0-1表达与CH组比较升高(P<0.01),QH组与QC组比较Nrf-2mRNA(?)及HO-1表达升高(P<0.01或P<0.05),Nrf-2蛋白表达无差异,QC组与CH组比较,Nrf-2蛋白表达升高(P<0.01),Nrf-2mRNA及HO-1表达无差异。单体与两两组合间比较,Q3组与QH组比较,Nrf-2表达降低(P<0.01),HO-1表达无差异,与QC组比较,Nrf-2蛋白表达降低(P<0.01),Nrf-2mRNA表达及HO-1表达无差异,与CH组比较无差异；H3、C3组与QH、QC、CH组比较均降低(P<0.01或P<0.05)。[结论]1.高糖可显著抑制(?)DRGn细胞活性,显著增加DRGn细胞凋亡率,增加I)RGn活性氧水平,降低Nrf-2/HO-1mRNA及蛋白的表达,上调NF-κB(P65)、IL-6、TNF-a及Caspase-3的mRNA及蛋白表达。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛三个单体均能够提高高糖条件下DRGn细胞的细胞活性,下调Caspase-3水平,减少DRGn细胞凋亡率,槲皮素作用优于水蛭素组和桂皮醛组,而水蛭素组作用优于桂皮醛组。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛均能降低高糖条件下DRGn细胞的ROS水平,槲皮素作用优于水蛭素,水蛭素作用优于桂皮醛；槲皮素和水蛭素可上调Nrf-2/HO-1通路,槲皮素作用优于水蛭素；槲皮素、桂皮醛可抑制NF-κB通路,桂皮醛作用优于槲皮素。4、槲皮素、水蛭素和桂皮醛组合能够显著提高高糖条件下DRGn细胞的细胞活性,下调Caspase-3水平,减少DRGn细胞凋亡率,其中槲皮素、水蛭素和桂皮醛三个单体组合作用优于单体单独干预组及两两组合组,与ALA组无统计学差异。5.槲皮素、水蛭素和桂皮醛三个单体组合在清除活性氧,上调Nrf-2/HO-1,抑制NF-κB通路激活的作用优于单体单独干预组及两两组合组；其抑制(?)NF-κB通路激活的作用优于ALA组,上调Nrf-2/HO-1作用与ALA组无明显差异。6.槲皮素、桂皮醛、水蛭素单体及其组合可清除活性氧,上调Nrf-2/HO-1通路,抑制NF-κB通路激活,下调TNF-a和IL-6的表达,下调Caspase-3水平,减少DRGn细胞的凋亡,从而起到抑制高糖条件对于DRGn细胞损伤的作用。[创新点]本课题应用细胞模型,从细胞分子水平探讨槲皮素、桂皮醛、水蛭素中药单体及组合在DPN发病过程中干预氧化应激及炎性通路致细胞凋亡的治疗效应；为中药复方的推广应用以及中药单体防治DPN提供实验依据。经检索国内外文献未见相关报道。