目的：膀胱癌是我国最常见的泌尿肿瘤。近年来研究发现，膀胱移行细胞癌从生物学行为到病理形态可分成低恶性与高恶性膀胱移行细胞癌两种类型(常被称之为两类癌)。两类癌概念的提出为人们从分子与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分类与研究提供了新的视角，并为阐明其发病机制与指导治疗，以及推测预后提供了更具科学性的依据，具有重要的理论与现实意义。因此，本研究即是在其指引下，寻找其差异表达蛋白，探究低恶性膀胱移行细胞癌的生物标记以及发病机制，进而揭示其发病规律。同时，这也正是膀胱癌研究领域亟待解决的难题之一。目前高通量研究蛋白质表达差异的主流技术是双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoreus，2-DE)，它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦(IEF)电泳，根据蛋白质等电点的不同进行分离。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的分子量不同进行分离。经过2DE以后，二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白，这样不同的蛋白即可被分离，有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得到。目前已经有几项膀胱肿瘤的的差异蛋白质组学研究，但鉴定的蛋白质数目很有限，并不能体现出蛋白质组学技术中的高通量，而且2DE蛋白质组学技术存在操作繁琐、不稳定和低丰度的蛋白不易检测等缺点，发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法成为国际蛋白质组学技术研究最主要的目标。二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱—毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。这些蛋白质分离技术需要的样本含量低，分离的效率高，而且不受分子量和等电点的限制。在充分考虑了2DE技术的缺点并分析了蛋白质组学技术进展后，本实验决定中采用质谱鸟枪法(Shotgun)即2D-LC-MS／MS质谱联用策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。另一个重要的原因是在2DE蛋白质组学技术中需要样本含量大很难采用LCM技术，而shotgun策略中由于蛋白质混合物分离方法的改进，对蛋白质上样量的需求减少，从而使的LCM与2D-LC-MS／MS的联合应用成为可能。本研究在天津市应用基础研究重点项目(043114211)和国家自然基金项目(30371601／C03031903)资助下，采用美国Thremo公司的ProteomeX-LTQ，结合激光捕获显微切割鉴定了低恶性移行上皮癌以及相应正常尿路上皮的蛋白质表达谱。在蛋白质鉴定的基础上构建了低恶性膀胱癌全蛋白质组表达开放数据库，初步筛选出了与低恶性膀胱癌发病相关的候选差异表达蛋白质，并结合功能聚类分析工具ArrayTrack和GenMAPP初步描绘了低恶性膀胱移行细胞癌相关的生物通路。进一步的分析中通过与本课题组前期工作中鉴定的高恶性膀胱移行细胞癌蛋白质表达谱相比对，寻找出了两类癌发生发展中肿瘤表型差异的分子基础。方法：1．激光捕获显微切割获得正常膀胱移行上皮细胞以及肿瘤细胞：采用Pix CellⅡLCM激光捕获显微切割设备获得正常移行上皮以及肿瘤细胞各250，000shots，裂解后分别获得185.2μg、147.6μg总蛋白，为进一步质谱分析奠定基础。2．使用Finnigan线性离子阱串联质谱仪(LTQ)进行液相色谱一串联质谱鉴定正常上皮以及肿瘤细胞的蛋白质表达谱，将实验结果与目前已经证实的膀胱癌及肿瘤差异表达蛋白进行比较，同时选择2个差异表达蛋白质进行免疫蛋白印迹以及免疫组织化学验证。3．生物信息学工具分析鉴定的蛋白质：使用蛋白质分析工具鉴定蛋白质的基本理化性质，包括总体平均亲水性，跨膜区预测，分子量以及等电点。并初步对比正常上皮细胞蛋白质表达与肿瘤细胞表达蛋白的理化性质。4．以本表达谱中鉴定的蛋白质为基础为蛋白质生物标记寻找进行循证生物医学探索，以期得到生物标记蛋白基本理化性质的特点。5．GO软件分析肿瘤蛋白质表达谱以及差异表达蛋白质谱。GO分析的同时计算GO浓集／缺失表达，以了解肿瘤的细胞生理，并与尿液中蛋白质的GO分析比对，探索尿液中侯选生物标记蛋白的来源。5．数据库构建：Dreamweave以及XMLeditor为主要软件构建开放蛋白质表达数据库。数据库内容包括TurboSequest软件产生的原始数据以及整理后的蛋白质列表，同时包括LCM的实验细节，标本准备，2D-LC-MS／MS，以及GO分析结果。6．通路分析及可视化。将正常上皮细胞以及肿瘤细胞差异表达蛋白质的IPI标记号转化为SWISSPORT-ACC-NUMBER，然后输入ArrayTrack V.3.3.0软件包，对目前已知的生物通路进行基因差异表达分析，检索生物通路数据库为KEGG.。将差异表达蛋白质的IPI标记号转化为Protein-RefSeQ，按照软件要求的格式输入GenMAPP软件，实现生物通路的可视化。同样的方法分析高恶性移行上皮癌的蛋白质表达谱为进一步分析两类癌的不同分子机制奠定基础。结果：1．蛋白质表达谱结果：440个蛋白质表达于肿瘤细胞，其中24个假定蛋白，24个疏水性蛋白质(5.5％)，TMHMM程序预测跨膜蛋白38个(8.6％)，84个(19.1％)蛋白质PI＞9；76个(17.3％)蛋白质分子量＜10 kDa或者＞100 kDa。218个蛋白质表达于正常上皮细胞，其中19个假定蛋白，11个疏水性蛋白质(5.0％)；TMHMM程序预测跨膜蛋白13个(6.0％)，40个蛋白质(18.3％)PI＞9；42个蛋白质(19.3％)分子量＜10 kDa或者＞100 kDa。肿瘤细胞及正常细胞间差异表达的蛋白质为388个，305个特异表达于肿瘤细胞，83个特异表达于正常上皮细胞。差异表达蛋白质中分子量最大以及最小值分别为7.86和1005.20 kDa，PI分布范围为3.67-11.91。2．免疫蛋白印迹以及免疫组织化学结果显示：NHERF在肿瘤组织中的表达明显上调(P＜0.05)，TPD52在肿瘤组织中特异性表达(P＜0.05)。免疫组织化学结果显示：TPD52和NHERF在膀胱癌中的表达阳性率明显高于正常膀胱粘膜中的表达阳性率，差异均有统计学意义(P＜0.01)。膀胱癌组织中TPD52的阳性表达率随着肿瘤病理分级的升高而增加(P＜0.05)，而与肿瘤浸润深度不具相关性(P＞0.05)。NHERF的表达与膀胱癌的病理分级、浸润深度均不具相关性(P＞0.05)。3．循证生物医学探索结果：129个蛋白质被定义为生物标记，其他蛋白为非生物标记，这两个蛋白组间PI，MW，GRAVY，跨膜区均没有统计学差异。按照PI区分蛋白质时，71个蛋白PI＞9，317个蛋白PI≤9，这两个组中分别有21和108个蛋白被定义为生物标记，这两个组之间的生物标记和非生物标记的PI均数以及标准差之间没有统计学差异。按照MW分组时，MW 10-100共305个蛋白，MW＜10或者＞100共83个蛋白。这两个组中分别有32和97个蛋白被定义为生物标记，这两个组之间的生物标记和非生物标记的MW均数以及标准差之间也没有统计学差异。2DE检测范围内蛋白中生物标记的检出率与检测范围外生物标记的检出率之间没有统计学差异。多元线形Logistic回归显示PI，MW，GRAVY，跨膜区与生物标记均没有相关性。4．GO分析结果：低恶性膀胱移行上皮癌中共鉴定440个蛋白质。按人类GO slim v1.8划分440个蛋白质中具有生物学途径、细胞成分、分子功能注解的蛋白质分别为312个(70.9％)、304个(69.1％)、346个(78.6％)。按照GO 4级分支术语生物学途径、细胞成分、分子功能中浓集／缺失表达的蛋白分别为41／22、25／11、23／20种。按人类GO slim v1.8划分差异表达蛋白质中具有生物学途径、细胞成分、分子功能注解的蛋白质分别为267个(68.8％)、256个(66.0％)、297个(76.5％)。细胞黏附、细胞增殖、细胞循环、细胞分化、细胞信号传导途径中的蛋白质分别为10、13、9、10、37个。5．数据库的构建：数据库包括4个主要内容：标本信息、实验过程、质谱鉴定数据、GO分析结果。质谱鉴定数据中包括蛋白质名称、蛋白质描述、多个蛋白质数据库的登陆号、MW以及PI、总体平均疏水性、跨膜结构。蛋白质的交叉数据库标记号也包括在质谱鉴定数据中，包括IPI，Swiss-port，TrEMBL，RefSeQ，Ensembl和H-Inv等。质谱鉴定数据采用XML格式。GO分析结果采用表格形式来描述蛋白质的生物学途径、分子功能以及细胞组分。按照GO分支术语将蛋白质聚类，储存于同一数据层，同时包括蛋白质的浓集／缺失表达分析。鉴定蛋白质的IPI标记号在数据库中与GO分支术语直接关联，因此拥有共同GO分支术语的蛋白列表于同一数据层，GO分析中同时包含GO浓集／缺失表达分析。在数据库中，用户可以在GO等级术语蛋白质列表中指定感兴趣的蛋白质，通过超链接可以获得储存于欧洲生物信息学研究所的GO术语信息以及蛋白质信息。同时为了方便用户查询，数据库中提供了简单的根据蛋白质标记号的查询服务。数据库储存于http://www.Proteome-NHTE.org.cn，及http://www.Proteome-SBTCC.org.cn。6．生物通路分析结果：ArrayTrack软件分析差异表达蛋白质，结果显示低恶性膀胱移行细胞癌中129个差异表达的蛋白定位于目前已知的生物通路，这些差异表达的基因主要属于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受体相互作用、Toll-like受体通路、细胞通信、聚合黏附、核糖体、MAPK信号通路等。高恶性移行细胞癌中181个差异表达的蛋白定位于目前已知的生物通路，通路分析结果显示，两类癌中涉及的差异通路基本一致，但每个通路中发生改变的蛋白并不相同。结果提示肿瘤发生发展过程中涉及多基因、多通路复杂的基因网络异常；两类癌存在不同的驱动机制。结论：1．本研究在国内首次联合应用激光捕获显微切割与蛋白质组学技术成功构建了膀胱癌差异表达蛋白谱。在低恶性膀胱移行细胞癌与相应正常膀胱粘膜之间选出388个差异表达蛋白质，其中包括305个特异表达于肿瘤细胞，83个特异表达于正常上皮细胞，说明膀胱癌发生发展过程中存在多蛋白质表达异常，这些差异表达蛋白质为膀胱癌分子机制研究提供了大量有价值的信息。2．在差异表达蛋白谱中挑取出2个差异蛋白TPD52，NHERF进行经典的免疫蛋白印迹检测，结果显示与正常膀胱粘膜比较，TPD52，NHERF水平在低恶性膀胱移形细胞癌中差异表达，而且这两个蛋白均通过一个肽段鉴定，证实了联合激光捕获显微切割与串联质谱进行表达谱研究的可靠性。应用免疫组化技术研究了TPD52和NHERF在膀胱癌组织中的表达及临床意义，结果显示：TPD52和NHERF在膀胱癌中表达阳性率明显高于正常膀胱粘膜中的表达阳性率，差异均有显著意义(P＜0.05)。膀胱癌组织中TPD52的阳性表达随着肿瘤病理分级的升高而增加(P＜0.05)，而与浸润深度无相关性(P＞0.05)。NHERF的表达与浸润深度、病理分级均不具相关性(P＞0.05)。3．循证分析的结果显示：PI、MW不能预测生物标记，尚需要发展其他方法来指导2DE蛋白质组学技术中对差异表达蛋白质的选择性切胶；Shotgun策略不但扩大了蛋白质的检出范围，同样扩大了生物标记的检出；蛋白质的基本理化描述，包括PI，MW，跨膜预测，GRAVY对生物标记的发现没有预测意义；尚需要发展其他的生物信息学预测方法来预测为知蛋白成为生物标记的可能性。4．对肿瘤蛋白质表达谱的GO浓集／缺失表达分析对深入了解低恶性浅表膀胱移行细胞癌的细胞生物学、发生发展机制提供了理论依据，并根据PubMed文本信息挖掘揭示了倾向于在尿液中浓集表达的蛋白质类别，为制备小型蛋白质芯片从尿液中无创检测肿瘤提供了理论依据，并进一步证实了本实验结果的可靠性。5．按照国际蛋白质组学研究惯例，在蛋白质鉴定信息以及功能分析的基础上，建立了开放数据库，为蛋白质信息交流和比对提供了平台。GO分支术语以及蛋白质列表均与欧洲生物信息学中心建立超链接。用户可以在任何等级指定GO术语，或者选定列表中的蛋白质，通过超链接获得储存于QuickGO(http://www.ebi.ac.uk/ego/)的GO数据或者存放于欧洲生物信息学研究所数据库(http://www.ebi.ac.uk/IPI)的蛋白质信息。6．系统水平上的低恶性膀胱移行细胞癌、高恶性移行细胞癌差异表达蛋白质功能聚类分析显示，差异表达蛋白主要归属于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受体相互作用、Toll-like受体通路、细胞通信、聚合黏附、核糖体、MAPK信号通路等，但两类癌差异通路中涉及的具体蛋白并不相同。这些通路很可能在两类癌的发生和发展过程中发挥重要作用。与由此可见，基于整个生物通路水平上的蛋白功能聚类与生物通路分析，可能会有助于从系统生物学的角度对肿瘤发生和发展进行再认识。同时两类癌生物通路中的差异蛋白为发展蛋白质芯片监测肿瘤进展以及评价预后奠定了基础。7．进一步深入研究这些差异表达蛋白及功能通路不仅有助于阐明膀胱癌发生发展的机制，而且还可能会为膀胱癌提供新的诊断和治疗靶点。