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目的:构建和筛选靶向EV71病毒VP1基因的高效siRNA表达载体;将筛选出的高效siRNA重组到减毒沙门氏菌中,构建以减毒沙门氏菌为载体、靶向EV71病毒VP1基因的口服基因重组治疗性疫苗。为运用RNAi技术治疗EV71引起的手足口病提供理论基础和实验依据。方法:采用DNA重组技术将EV71病毒的VP1基因序列和靶向EV71病毒的VP1基因的siRNA克隆到含U6启动子、H1启动子和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pSEB-HUS载体中,构建重组质粒pSV,经限制性内切酶消化、PCR扩增及DNA序列测定等方法鉴定后,再将靶向EV71病毒的VP1基因的siRNA克隆到重组质粒pSV中,构建成重组质粒pSVsi1、pSVsi2、pSVsi3和pSVsi4,经DNA序列测定鉴定证实插入的siRNA序列正确后,转染A549细胞,用倒置荧光显微镜初步观察绿色荧光蛋白的表达情况;用荧光实时定量RT-PCR检测VP1基因mRNA转录水平,免疫细胞化学检测细胞中的VP1基因的表达水平,进而分析siRNA对VP1 mRMA转录和蛋白表达的抑制作用。筛选出抑制效率最高的siRNA,构建重组质粒pSsi1,并将其转化进减毒沙门氏菌中,进而探索以RNAi技术为基础、减毒沙门氏菌为载体的口服治疗性疫苗的可行性。结果:经限制性内切酶、PCR、测序及Western Blot证实:成功构建可以表达EGFP的、靶向EV71病毒VP1基因的siRNA表达载体;从已构建的3个靶向VP1基因的siRNA表达载体中,筛选到可高效抑制VP1基因表达的pSVsi1,其VP1 mRNA和VP1蛋白的抑制率分别为87%和89%;成功构建si1的重组质粒pSsi1,并将其成功的转化进减毒沙门氏菌中。结论:1.成功构建以pSEB-HUS为载体的重组siRNA表达质粒,为今后运用该质粒进行RNAi相关研究奠定了物质基础;2.筛选到对EV71病毒VP1基因的表达有一定抑制作用的siRNA,并将其重组质粒pSsi1成功转化进减毒沙门氏菌中,不仅为研究RNAi治疗由EV71引起的手足口病提供了物质基础,而且表明用RNA干扰技术抑制细胞内EV71病毒VP1基因的表达、进而治疗由EV71引起的手足口病是可行的。3.本研究设计的三个靶向EV71病毒VP1基因的序列,均对VP1的表达有大于50%的抑制率,说明RNA干扰对所靶向的mRNA的序列和部位依赖性不强,因此进一步预示了此项技术的可行性。