论文部分内容阅读
CD34是一跨膜的唾液粘蛋白分子，在1％-3％的人骨髓细胞表面表达。由于骨髓中的CD34+细胞承担了绝大部分的造血活力，因此CD34分子一直被认为是造血干细胞的阳性标志。基础研究及临床应用都是基于对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞的。但是，近年来应用胎羊及免疫缺陷小鼠移植模型进行的相关研究表明，一群不表达各系特异性标志并且也不表达CD34分子的Lin-CD34-细胞移植条件受者后，也能重建受者长期多系造血及免疫功能。进一步研究发现它们具有许多不同于CD34+造血干／祖细胞的特性：首先，Lin-CD34-细胞移植的受者，重建长期造血的能力更强，免疫功能的重建比CD34+细胞移植更迅速，形成嵌合体的比例更高；其次，在体外，CD34-细胞具有高度增殖并分化产生大量的CD34+细胞的潜能，这可弥补CD34+造血干细胞在体外难以扩增的局限；再次，最近有研究发现，CD34-AC133+细胞的转染效率比CD34+CD38-细胞高4倍，这在造血干细胞基因治疗中将会有重要意义。因此，通过对Lin-CD34-和Lin-CD34+这两群非常相近的细胞的基因表达情况进行比较，找出Lin-CD34-细胞特异表达的、可能与其性状相关的基因，将为其临床应用提供理论依据。 在建立了两步法负性筛选Lin-CD34-细胞的基础上，利用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）构建了Lin-CD34-细胞与Lin-CD34+细胞差异表达基因的cDNA消减文库。所建cDNA消减文库共挑选克隆590个，经PCR鉴定后，任意选取其中60个阳性克隆进行测序，测序结果与Genbank序列数据库进行同源性比较。结果60个克隆共代表16个基因的EST序列，其中4个为新基因的EST，12个为已知基因的EST，包括BTF3、ZASP、MAPK6、Humanin等基因。有研究表明，在自我更新的信号传导过程中抗凋亡的信号通路可能是重要的组成部分，因此，随后的实验从文库中选择了已发现在神经系统具有抗凋亡作用的Humanin进行深入研究。 Humanin是新近从家族性Alzheimer氏病（Familial Alzheimer’s disease，FAD）患者脑皮质中获得的一个基因，它能够特异性地抑制多种FAD基因，如APP、PS-1、PS-2等引起的神经细胞凋亡。虽然Humanin的全长转录本有1，567bp，但其编码框只有75bp，编码一个24个氨基酸的多肽。进一步的研究发现，Humanin对于引起FAD的其它因素诱导的神经细胞凋亡也同样具有保护作用，它还有助于小鼠受损的学习和记忆功能恢复。 本课题对Humanin基因的研究主要集中在两个方面：其一，Humanin编码基因的定位，即Humanin是由核编码的还是由线粒体编码的?其二，Humanin在非神经 系统，如造血系统中，是否同样具有抗凋亡的作用，其机制又是如何？ 通过对Hurnanin序列的同源性分析以及RTPCR和原位杂交提供的实验证据， 初步认为Hurnanin由线粒体编码。但是，HUmanin的24个氨基酸的序列是利用哺 乳动物细胞核的标准密码子翻译得到的，与其基因由线粒体编码相矛盾。最近发表 在NatUre上的一篇文章证明，如果用线粒体的密码子来翻译原来的HUmhon序列， 得到C末端少3个氨基酸的多肽，仍然具有同样的抗凋亡作用。所以对于Humanin 的来源还需要进一步的实验证据。 在本实验研究中，首先用原核表达的Hurnanin多肽免疫家兔，制备了它的多克 隆抗体。用兔疫细胞化学方法检测表明，Humanin定位于HeLa细胞的胞浆和核仁。 核仁是核糖体RNA合成及组装的场所，Humanin定位于此的作用还不清楚。推测 Humamn多肽C－末端2个带正电荷的精氨酸可能参与了这一定位，因为核／核仁定 位信号（nuclear acleolar localization signal，NLSMOS）常富含精氨酸。 随后应用酵母双杂交技术筛选到可能与Humanin存在相互作用的分子，其中功 能明确的主要有四类：一类是伴侣分子，如 HSP40，TCP；一类是转录调节因子， 如 JAB，erm；一类是呼吸链上的分于，如细胞色素。氧化酶亚单位＊，ATP合成 酶 FO亚单位；还有一类是代谢相关的分子，如 N－乙酚氨基葡萄糖转移酶。 本研究初步验证了Humanin与JABI和HSP40的相互作用。Humanin与JABI 的相互作用用 AP－l报告基因实验验证，结果显示 Humanin通过与 JAB的相互作 用抑制了 AP－l转录活性，而加入 JAB反义核酸后，这一抑制作用被解除。体内 HSP40主要是协助HSP70发挥作用，所以我们研究了在热应激后，Humanin与HSP70 的共定位，以从侧面反映Humanin与HSP40的作用关系。在未处理的HeLa细胞中， HSP70定位于胞浆，且表达量较低；在42aC热激处理Zhr后，HSP70上调表达并移 位于核仁，此时Htnnanin仍定位在核仁；在热应激处理后37oC恢复1，3hr，Humanin 与HSP70同时移出核仁，此时Htunanin主要定位于胞膜及胞膜下，而HSP70主要