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第一部分ADAMTS13及其突变体重组蛋白的纯化和鉴定目的：为了研究ADAMTS13及其突变体的功能,纯化并鉴定高纯度和生物学活性的ADAMTS13及其突变体的重组蛋白,为后续实验打下重要基础。方法：设计针对ADAMTS13及其突变体基因序列的特异性引物,PCR方法获得目的DNA基因片段,并克隆至pcDNA3.1-V5-His TOPO载体上。将成功构建的ADAMTS13及其突变体质粒转染HEK293细胞,western blot检测各细胞的蛋白表达情况。通过G418筛选获得稳定表达细胞,收集稳定细胞所表达ADAMTS13及其突变体重组蛋白的培养上清,依次通过Q-fast flow离子结合柱,Ni-NTA亲和层析柱以及分子筛以获得各种纯化的重组蛋白,采用考马斯亮蓝染色检测其纯度和分子量大小。结果：成功构建ADAMTS13及其突变体的表达载体,并在真核细胞内稳定表达。经过纯化的各种重组蛋白纯度很高且分子量大小正确。结论：体外成功表达并纯化ADAMTS13及其突变体的重组蛋白,为后续的实验打下重要基础。第二部分ADAMTS13及其突变体功能的体外实验研究目的：研究体外剪切力条件下,比较同等特异性活性的ADAMTS13及其突变体delCUB、MDTCS裂解vWF的时间依赖性,酶浓度依赖性和底物浓度依赖性的差异。方法：应用FRETS-VWF73作为底物,检测ADAMTS13及其突变体的特异性活性。并在剪切力2500rpm(即2.5dyn/cm2)时,分别于不同时间(0,10,20,30和60 min),不同酶浓度(特异性活性0,12.5,25,50,100,200和300mU/ml)或不同底物VWF多聚体浓度(0,18.75,37.5,75,150,300 nM)条件下,运用1% agarose凝胶电泳研究ADAMTS13及其突变体裂解VWF多聚体能力的差异。结果：在ADAMTS13及其突变体特异性活性相同时,ADAMTS13及其突变体裂解VWF多聚体能力均随剪切力作用时间延长,酶浓度增加和底物浓度增加呈现最初快速增加之后缓慢增加的趋势,且ADAMTS13及其突变体各组之间对VWF多聚体的裂解能力均无统计学意义(p>0.05)。结论：ADAMTS13及其突变体在体外剪切力条件下,裂解VWF多聚体具有相似能力。第三部分ADAMTS13及其突变体功能的体内实验研究目的：研究ADAMTS13及其突变体的重组蛋白在动物体内血栓形成过程中功能的差异。方法：1.ADAMTS13的FL或MDTCS重组蛋白注射入ADAMTS 13基因敲除(ADAMTS13-/-)小鼠体内,应用10%的FeCl3损伤右侧颈动脉,Doppler探头检测血管损伤处血栓完全形成的时间。注射PBS和缺失C结构域六个氨基酸的重组蛋白(del6aa)作为对照组。将TSP5-8CUB重组蛋白注射入野生型C57BL／6小鼠体内,同样应用10％的FeCl3损伤右侧颈动脉,Doppler探头检测血管损伤处血栓完全形成的时间。比较各种蛋白在FeCl3损伤颈动脉血栓形成动物模型中完全形成栓塞时间的差异。2.ADAMTS13的FL或MDTCS重组蛋白与荧光(calcein AM)标记的血小板分别注射入ADAMTS13-/-小鼠体内,应用10%的FeCl3损伤肠系膜动脉5min,在体荧光显微镜和摄像装置记录实时血栓形成和完全栓塞的时间,比较各种蛋白在FeCl3损伤肠系膜动脉血栓形成动物模型中完全形成栓塞时间的差异。结果：1.注射PBS,FL,MDTCS或del6aa的ADAMTS13-/-小鼠完全形成栓塞的时间分别为5.3±0.4min,12.7±1.7min,22.0±2.1min,5.9±1.9min,WT小鼠完全形成栓塞的时间为10.0±1.3min,注射TSP5-8CUB的WT小鼠完全形成栓塞的时间为5.5±2.1min.PBS组与WT组之间,FL组与PBS组之间,MDTCS组与PBS组之间均有统计学意义(p<0.01),并且FL组与MDTCS组之间也有统计学意义(p<0.01)。e16aa组与PBS组之间,TSP5-8CUB组与WT组之间均无统计学意义(p>0.05)。2.FeCl3诱导肠系膜动脉损伤形成血栓时间,WT小鼠为12.5±1.2 min,注射PBS的ADAMTS13-/-小鼠为8.5±0.6 min,两组之间有统计学意义(p<0.01)；FL组为17.1±1.9min,MDTCS组为17.2±1.8 min,FL和MDTCS两组分别与PBS组比较,有统计学意义(p<0.01)。结论：MDTCS足以裂解新释放的vWF,并且对于FeCl3诱导的动脉性血栓具有保护性作用；其中,S结构域在ADAMTS13体内酶学功能十分重要；TSP5-8CUB具有体内抗血栓形成功能。