胸部放疗是治疗肺癌、食道癌、乳腺癌以及多种淋巴瘤等的常用方法之一。然而由于肺组织对电离辐射具有中度敏感性,胸部放疗后容易引起放射性肺炎及肺纤维化。放射性肺炎出现于胸部照射后早期(3个月内),临床症状为低度发烧,中度咳嗽等;随着肺炎的进展,可于照射后晚期(6个月后)出现肺纤维化的症状,主要特征为成纤维细胞过度增生,胶原和细胞外基质大量沉积,临床表现为慢性呼吸衰竭等不可逆的症状,最终导致患者死亡。由于放射性肺纤维化的发病率较高、预测性低、治疗困难,且死亡率高于原发癌症,严重影响了放疗的临床应用。因此放射性肺纤维化的治疗已成为放射医学临床及基础研究的热点之一,其发生发展机制的研究将为预防或缓解放射性肺纤维化提供重要理论依据。我们的前期研究表明,放射性肺纤维化发生过程中肺内调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Treg)增多,导致免疫平衡向Treg偏移。Treg是CD4+T细胞的亚群,具有免疫调节功能,对于维持机体免疫耐受和内稳态具有至关重要的作用。与其他T淋巴细胞相比,Treg对电离辐射具有较高耐受性。而已有文献报道Treg参与多种纤维增生性疾病的发病,因此本工作对Treg在放射性肺纤维化中的作用进行研究,为其治疗提供新的线索。成纤维细胞是肺纤维化的关键效应细胞,其分泌产生的胶原过度沉积是纤维化发生的主要原因。现有研究表明,在病理状态下,除原发灶增殖外,骨髓来源的循环纤维细胞(circulating fibrocyte)的分化及肺泡上皮细胞发生上皮间质转化(Epithelia mesenchymal transitions,EMT)也是成纤维细胞的重要来源,参与了多种纤维增生性疾病的发病。Fibrocyte是骨髓来源的前体细胞,具有分泌胶原、参与抗原提呈等重要功能。上皮间质转化(Epithelia mesenchymal transitions,EMT)主要包括上皮细胞极性丢失、细胞骨架重排、间质细胞特征获得等重要的生物学过程。有研究表明,循环纤维细胞分化及上皮细胞EMT受多种免疫因子的调控,并与免疫平衡状态相关。而Treg是维持免疫平衡的重要因素,对循环纤维细胞分化及上皮细胞EMT具有潜在的调节作用。因此本课题旨在研究Treg在放射性肺纤维化发生发展中的变化规律,阐明其对放射性肺纤维化的作用以及可能的调节机制,为防治或缓解放射IV性肺纤维化提供有效靶点和相关实验依据。工作主要内容如下:1.建立小鼠放射性肺纤维化模型。以C57BL/6小鼠为受试对象,采用20Gy 60Coγ射线对小鼠进行单次全胸部照射。结果显示,小鼠接受全胸部照射后,体重增长变缓,外周血白细胞骤减。肺组织HE染色结果显示,照射后2周内,小鼠肺泡腔中出现渗出液,支气管上皮细胞脱落;照射后1个月到6个月,肺泡结构改变,肺泡融合及肺泡萎陷的现象增多,随时间延长纤维化症状逐渐加重。Masson三色染色结果显示,照射后1个月到6个月,小鼠肺间质中纤维增生,胶原沉积,与总胶原含量测定结果相符。流式细胞检测结果显示,在照射后1周内,外周血中Treg细胞占CD4+T细胞比例减少,在第14天时短暂升高后恢复正常水平,而肺组织中Treg从第14天到6个月内持续升高。2.建立Treg抑制模型,观察Treg抑制对放射性肺纤维化的作用。采用腹腔注射抗CD25抗体抑制小鼠Treg增高。流式细胞检测结果显示,胸部照射小鼠注射抗CD25抗体后外周血及肺内Treg的增高受到抑制,照后14d起肺内Treg比例与未照射组小鼠相当。肺组织病理切片HE染色结果显示,Treg被抑制后,受照小鼠肺组织肺泡结构破坏减少,肺泡融合现象减弱,Masson三色染色显示肺间质胶原分布减少,表明肺纤维化的症状减轻。以上结果表明,抑制Treg可减缓肺纤维化的发生,提示Treg参与促进放射性肺纤维化的发病。3.Treg通过影响CD4+T细胞,以及Th1/Th2细胞因子之间的平衡参与放射性肺纤维化的发病。小鼠胸部照射后,流式细胞检测结果显示,肺内CD4+T和Th17的细胞比例和数量在纤维化阶段增加;当Treg被抑制后,两种细胞的细胞数进一步升高。细胞因子检测结果显示,小鼠受照后,肺组织中的Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-1α)和Th2型细胞因子(IL-10、IL-6、IL-4和IL-5)含量在纤维化阶段均高于未照射组;当Treg被抑制后,小鼠肺组织中Th1型细胞因子含量升高,Th2型细胞因子含量降低,细胞因子向Th1型极化。以上结果表明,Treg可能够通过抑制Th17分化,扰乱Th1/Th2细胞因子之间的平衡,促进放射性肺纤维化形成。4.Treg调节循环纤维细胞分化参与放射性肺纤维化中的发病。动物模型显示,小鼠受照后肺组织中的循环纤维细胞数增加与肺纤维化增生一致,与Treg的变化趋势吻合;当Treg被抑制后,小鼠肺组织中的循环纤维细胞数明显降低。趋化因子检测结果显示,小鼠受照后,肺组织中的趋化因子CCL2和CCL3含量明显升高,与循环纤维细胞变化趋势一致;当Treg被抑制后,小鼠肺组织中CCL2及CCL3含量降低,但仍高于未照射组。以上结果表明,Treg可能通过促进循环纤维细胞在肺部的聚集而加速放射性肺纤维化,而循环纤维细胞聚集由趋化因子CCL2及CCL3介导。采用分离的小鼠脾脏Treg和单个核细胞建立共培养体系。流式细胞仪检测结果显示,培养14天后,Treg与单个核细胞共培养体系中纤维细胞的比例增高,并与Treg比例具有剂量效应关系,表明Treg能促进循环纤维细胞的分化。细胞因子检测结果显示,共培养细胞上清中CCL2和CCL3趋化因子含量高于Treg或单个核细胞单独培养条件下的含量。以上结果证明了Treg可能通过CCL2、CCL3促进循环纤维细胞在肺部的聚集和形成,是其参与放射性肺纤维化的机制之一。5.Treg通过β-连环蛋白调节上皮细胞EMT参与对放射性肺纤维化中的发病。在动物实验中,免疫荧光的结果显示,在小鼠肺纤维化阶段,肺泡上皮细胞中的间质细胞标志物N-钙粘素(N-cadherin)表达增加,并随照后时间的延长,上皮细胞标志物的细胞表面蛋白C(Pro-surfactan protein C,SPC)逐渐丢失,提示放射性肺纤维化发病过程中EMT增强;抑制Treg后,小鼠肺组织上皮细胞N-cadherin表达减弱,SPC丢失减轻,表明EMT减弱。免疫组化结果显示,EMT重要信号通路蛋白β-连环蛋白(β-catenin)在肺组织上皮细胞胞浆和胞核中表达增加;而抑制Treg后,β-catenin表达降低,提示Treg可能通过β-catenin调节上皮细胞EMT参与对放射性肺纤维化中的发病。建立体外辐射诱导EMT的细胞体系,以及小鼠肺上皮细胞系(MLE12)经照射后与原代分离的小鼠脾脏Treg细胞共同培养的体系。流式细胞仪检测结果显示,其EMT发生率为13.2%,显著高于照射后的MLE12单独培养(9.3%,p<0.05)。Western blot结果显示,在共培养条件下,MLE12中β-catenin的表达高于MLE12单独培养情况。采用RNAi下调MLE12细胞β-catenin的表达,结果表明,与未干涉细胞相比,下调β-catenin后Treg诱导MLE12发生EMT的比例下降(14.3%vs 16.2%,p<0.05)。上述结果提示β-catenin介导的EMT的发生是Treg调节放射性肺纤维化发生发展的另一机制。综上所述,我们成功建立了放射性肺纤维化模型,证明了Treg参与放射性肺纤维化发展的过程,验证了Treg通过抑制Th17分化、扰乱Th1/Th2型细胞因子平衡、通过趋化因子CCL2、CCL3增加纤维细胞在肺部的聚集及分化、促进β-catenin介导的EMT的发生,从而促进放射性肺纤维化的形成。本课题的研究成果为利用抑制Treg的措施缓解并治疗放射性肺纤维化提供了重要参考。