[研究背景]胃癌是一种常见的恶性肿瘤,其死亡率在全世界特别是东亚国家如中国、韩国等地居高不下。最新文献报道每年有640000男性和350000女性被诊断为胃癌。同时每年有464000男性和273000女性死于胃癌。90%肿瘤患者的死亡都是由于肿瘤的侵袭转移引起的。因此,有必要对胃癌的侵袭转移进行研究,以减缓患者的死亡。肝素酶(HPA)作为细胞内唯一一种内源性核苷内切酶被认为在肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。肝素酶通过降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖,可以使绑定在细胞外基质中的相关细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的释放,从而使其能够结合于上皮细胞表面,从而促进细胞的增殖及迁移。然而,目前有关调控肝素酶表达的分子机制研究较少。目前已经证实在肿瘤组织中突变的或者失活的p53基因能够促进肝素酶的表达。同时,也有文献证实SP1及Ets家族在促进肝素酶表达的过程中发挥重要作用。我们前期也证实,靶向肝素酶的T细胞多肽疫苗能够显著抑制肿瘤的生长及侵袭转移,此结果提示肝素酶在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用。因此,有必要探索肝素酶在胃癌中表达的具体机制。c-met作为一种癌基因广泛表达于肿瘤细胞的表面并且在多种肿瘤如肝癌、乳腺癌、骨肉瘤及脑肿瘤的发生发展中发挥了重要作用。我们前期通过30例临床标本发现c-met及HPA在胃癌组织中的表达较癌旁组织明显增加,同时c-met和HPA在胃癌组织中的表达呈明显正相关(P<0.01)。同时,既往文献报道,肝细胞生长因子(HGF)通过与c-met结合,能够激活一系列信号通路如PI3K/Akt、ERK、NF-κB及STAT3进而促进靶基因的表达,从而促进肿瘤的侵袭转移。那么HGF/c-met信号通路是否可以促进HPA的表达,从而促进胃癌的侵袭转移,此研究尚未有文献报道。因此,本课题在国家自然科学基金的资助下。系统的研究了胃癌组织及细胞中HGF、c-met及HPA的表达情况,并从分子水平阐明了HGF/c-met可以通过激活PI3K/Akt信号通路,进而活化NF-κB信号通路从而促进p65入核,使其结合于HPA启动子的-769～-760 bps区,在转录水平促进肝素酶的表达,进而促进胃癌细胞的侵袭转移。[实验方法]1.通过免疫组化检测HGF及HPA在58例胃癌组织及癌旁组织中的表达情况。统计分析HGF及HPA的表达与胃癌患者的临床病理分期(性别,年龄,肿瘤大小,分化,TNM分期,侵润深度及淋巴及转移)的关系。进一步分析肝HGF与HPA之间的相关性,研究HGF和HPA的表达与胃癌患者生存的关系。2.通过qRT-PCR及Western blot实验分析外源性肝细胞生长因子分别刺激MKN74和MKN45细胞后,肝素酶mRNA和蛋白的表达变化情况。3.肝细胞生长因子刺激MKN74和MKN45细胞的同时加入c-met特异性抑制剂Sul1274,共同培养24小时。Western blot检测肝素酶蛋白表达的变化。4.肝细胞生长因子分别刺激MKN74和MKN45细胞0,15,30,45,60,90分钟后收集蛋白,Western blot检测磷酸化AKT及磷酸化p65蛋白表达变化。进一步加入P13K/Akt的抑制剂GSK及NF-κB信号通路的抑制剂Bay,检测磷酸化AKT及磷酸化p65蛋白表达变化。5.HGF刺激MKN74细胞的同时分别加入Su11274,GSK和Bay后培养24小时,Western blot检测肝素酶表达的变化情况。6.双荧光素酶实验验证肝细胞生长因子是否可以提高肝素酶启动子的活性。7.生物信息学预测p65与肝素酶启动子结合的潜在结合位点。8.根据生物信息学预测结果,进一步通过染色质免疫共沉淀验证p65与肝素酶启动子的具体结合位点。9.CCK-8实验,划痕实验,Transwell实验及裸鼠腹腔转移实验分析肝细胞生长因子及肝素酶在胃癌侵袭转移中的作用。10.酶联免疫法检测过表达肝素酶后MKN74细胞和干扰肝素酶后MKN45细胞的肝细胞生长因子的表达情况。[实验结果]1.证实HGF及HPA在58例胃癌组织中明显高表达,并且与胃癌患者的不良预后密切相关。通过免疫组化实验发现在58例临床标本中HGF在胃癌组织的表达较癌旁组织中明显增高(P<0.001); HPA在胃癌组织中的表达亦较癌旁组织明显升高(P<0.001)。进一步分析发现,HGF高表达与胃癌患者的TNM分期,淋巴及转移及侵润深度密切相关。同时HPA高表达与胃癌患者的TNM分期及侵润深度密切相关。进一步发现HGF高表达与胃癌患者的不良预后密切相关。同样胃癌组织高表达HPA与患者的不良预后密切相关。最后,Pearson相关性分析发现HGF及HPA在胃癌组织中的表达呈明显正相关(R=0.7011,P<0.001)。2.HGF刺激能够明显增加MKN74细胞HPA的表达,但对MKN45胃癌细胞HPA的表达则没有影响。qRT-PCR发现当加入肝细胞生长因子刺激1小时后,MKN74细胞的肝素酶表达明显增加。然而肝细胞生长因子刺激对MKN45细胞肝素酶mRNA表达没有影响。Western blot同样发现肝细胞生长因子刺激能够显著增加MKN74细胞肝素酶蛋白的表达,但对MKN45细胞没有影响。肝细胞生长因子刺激同时加入c-met抑制剂Sul1274后MKN74和MKN45细胞的肝素酶的表达明显下降。3.证实HGF/c-met通过激活PI3K/Akt信号通路及下游的NF-κB信号通路促进HPA的表达。Western blot发现HGF刺激MKN74细胞30分钟后磷酸化AKT的表达明显增加,而刺激45分钟后磷酸化p65的表达明显增加。进一步在HGF刺激MKN74细胞的同时,加入GSK及Bay后发现,Bay对磷酸化AKT的表达没有影响而GSK能够明显抑制磷酸化p65的表达。由此说明,肝细胞生长因子首先激活PI3K/Akt信号通路进而激活下游的NF-κB信号通路。进一步HGF刺激MKN74细胞的同时加入Su11274,GSK和Bay后共同培养24小时,发现加入抑制剂后肝素酶的表达明显减少。以上结果充分说明,肝细胞生长因子通过激活PI3K/Akt信号通路进而激活下游的NF-κB信号通路促进肝素酶的表达。4.证实p65通过结合于肝素酶启动子促进HPA的表达。双荧光素酶实验证实,肝细胞生长因子能够明显增加肝素酶启动子活性。进一步通过生物信息学预测发现,p65在肝素酶的启动子区有3个潜在的结合位点。构建相关引物后通过染色质免疫共沉淀实验发现,p65能够特异性的结合于肝素酶启动子-769～-760 bps区,但并不能结合于其他两个结合位点。进一步我们构建了缺失突变-769～-760 bps区的肝素酶启动子,再次进行双荧光素酶实验发现肝细胞生长因子并不能提高突变后的肝素酶启动子活性。以上结果充分证实p65通过结合于肝素酶启动子-769～-760 bps区促进其表达。5.体内外实验证实HGF/c-met-HPA信号通路在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用。划痕实验及Transwell实验证实HGF能够显著促进MKN74细胞的侵袭转移能力,而其对MKN45细胞的侵袭转移则没有影响。但是HGF刺激的同时加入Bay后,MKN74和MKN45细胞的侵袭转移能力均明显下降。由此说明,HGF及NF-κB信号通路在胃癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用。进一步当在MKN74细胞过表达肝素酶后,Transwell实验发现过表达肝素酶后MKN74细胞的侵袭转移能力明显增强。而在MKN45细胞中干扰肝素酶后其侵袭转移能力明显减弱。以上结果证实肝素酶在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用。在体内实验中,干扰肝素酶表达的MKN45细胞在小鼠腹腔形成的转移瘤数量较对照组的转移瘤数量及大小明显减少,再次通过体内实验验证肝素酶在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用。6.证实HPA可以反向调控HGF的表达。在MKN74细胞中过表达肝素酶后,上清中的肝细胞生长因子表达较对照组明显升高。相反,在MKN45细胞中干扰肝素酶后,上清中的肝细胞生长因子表达较对照组明显降低。以上结果充分说明,肝素酶可以反向调控肝细胞生长因子的表达。[结论]1.HGF和HPA在胃癌组织的表达明显高于癌旁组织(p<0.001),并且与患者的不良预后预后密切相关;HGF和HPA在胃癌组织中的表达呈明显正相关(R=0.7011,p<0.001)。外源性HGF通过与c-met结合促进MKN74细胞肝素酶的表达,但对MKN45细胞没有影响。2.HGF结合于c-met激活PI3K/Akt信号通路及下游的NF-κB信号通路促进肝素酶的表达。p65入核后结合于肝素酶启动子-769～-760 bps区促进肝素酶的表达。3.HGF及肝素酶在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用。4.肝素酶可以反向调控HGF的表达,从而形成正向反溃调控通路,在胃癌细胞的侵袭转移过程中发挥重要作用。总之,通过本课题我们证实HGF通过结合于其特异性受体c-met激活PI3K/Akt信号通路及下游的NF-κB信号通路,进而使p65入核后结合于肝素酶的启动子促进其表达。另外肝素酶可以反向调控肝细胞生长因子的表达进而促进的肿瘤的侵袭转移。