研究背景在临床麻醉过程中,不同麻醉药物的使用,患者会有不同程度的剂量依赖性的循环抑制效应,主要通过降低心肌收缩力引起心输出量减少而导致血压下降(严重者甚至引发休克),造成心脑肝肾等重要脏器的血液灌注减少,损害其功能。麻醉医生逐渐认识到,这对手术患者,尤其是对合并有高血压、冠心病、脑血管病、糖尿病等疾患的手术患者可能造成严重的器官功能损害。钙离子在心肌收缩过程起着至关重要的作用,心肌细胞膜去极化后,心肌细胞膜上的L-型钙通道开放引起Ca2十内流,这些Ca2+作用于肌质网上的雷诺停受体(ryanodine receptor, RyR,其本身就是钙通道)引起钙诱导的钙释放,Ca2+与肌钙蛋白C (cTnC)的亚基结合后,促使粗细肌丝相互滑动,心肌细胞收缩。异丙酚,又名丙泊酚,是临床上常用的静脉麻醉药,具有苏醒迅速而完全,持续输注无蓄积等特点,除了常规的镇静、催眠外,目前认为,异丙酚还具有一定的循环系统的抑制作用,临床麻醉过程及部分基础研究都表明,异丙酚可以抑制心输出量及心肌收缩。本研究则采用急性分离心肌trabeculae的方法,可以完整地保存trabeculae肌条的活性,同时检测不同异丙酚对trabeculae肌条收缩力所对应的细胞内钙离子浓度,系统地阐明不同浓度的异丙酚(主要是临床浓度)负性肌力作用的可能机制。除了异丙酚对心脏收缩功能的抑制作用,在临床心外科麻醉及研究中,我们还发现,异丙酚的应用可以显著降低患者血液中肿瘤坏死因子-a (TNF-a)和白介素-6(IL-6)的含量,抑制患者心脏手术过程中的免疫反应,影响患者的预后,这提示我们麻醉与机体免疫功能之间的关系。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,可以在很多方面对机体实施保护作用。NADPH氧化酶系(NOXs)是一类过氧化物酶,广泛存在免疫细胞内,其催化产物ROS参与机体防御和信息传递等许多生理过程,NADPH氧化酶是由LPS诱导的催化巨噬细胞分泌ROS的主要酶,作为固有免疫的一部分,消灭侵入机体的外来病原体。ROS在调节巨噬细胞功能方面起着重要作用,而NADPH氧化酶是细胞内ROS的主要来源,可知NADPH氧化酶也是调节巨噬细胞分泌细胞因子功能的重要因素。以往的研究多集中于异丙酚对胞内ROS含量的影响,而对于异丙酚如何降低细胞内ROS的具体机制尚未阐明。本研究以RAW264.7巨噬细胞系为研究对象,研究LPS刺激时,异丙酚抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的具体机制。首先,通过Elisa检测异丙酚对巨噬细胞TNF-α和IL-6释放的影响,并用Western Blot检测NF-κB的磷酸化,接着通过DHE染色技术,直观的反映出异丙酚对ROS含量的影响,最终通过对NADPH氧化酶的活性和含量的检测,将我们的研究集中于异丙酚对LPS诱导的巨噬细胞内NOX2/ROS/NF-κB信号通路上。第一部分 心肌肌丝钙离子敏感性在异丙酚抑制心肌收缩力中的机制研究目的本研究则采用急性分离心肌trabeculae的方法,可以完整地保存trabeculae肌条的活性,同时检测不同trabeculae肌条收缩力所对应的细胞内钙离子浓度,系统地阐明不同浓度的异丙酚(主要是临床浓度)负性肌力的作用的可能机制。方法1. Trebaculae肌条的分离及悬挂选取成年清洁级健康BrownNorway大鼠,开胸,取心脏,在显微镜下,沿右心室三尖瓣环侧寻找合适的Trebeculae肌肉,将Trebeculae肌条分离下来。将分离好的肌条小心的挂到肌张力测定器上(挂肌条过程中尽量不要触碰肌肉,以免损伤肌条功能),挂上后,拉伸肌条,先将肌条拉至一定初长度,溶液中钙离子浓度维持在1.0 mM,刺激强度0.5Hz,稳定30mins后,调整肌条至最适初长度。2. Trebeculae肌条内钙离子浓度的检测用微电极拉制仪拉出玻璃微电极,将微电极瞬间划入Trebeculae肌条内,通过变换不同激发波长(340nm/380nm)观察荧光染料的注射情况。注射完成后,打开刺激仪,Fura-2荧光染料通过细胞间的缝隙连接,均匀的扩散至整个肌条。稳定20mins后,分别激发340nm和3801nm两种波长,记录荧光强度。3. Trebeculae肌条持续收缩状态的激发加入Ryanodine(雷诺定)至Trebeculae肌条perfusion溶液中,分别在不同钙离子浓度,刺激频率10 Hz的强度下,激发Trebeculae肌条的持续收缩状态,测定不同浓度细胞外钙离子所对应的Trebeculae肌条收缩力及相应的肌条内钙离子浓度。4. Trebeculae肌丝持续收缩状态的激发Trebeculae肌条持续收缩状态激发实验完成后,停止灌注,向肌张力测定器内加入1% Triton X-100。用relaxing solution冲洗几次,按照activating solution溶液激活浓度梯度,在不同浓度钙离子的activating solution下,记录肌丝的收缩力。5.肌丝横桥Mg2+-ATPase功能的检测(1)活性心肌肌丝的制备选取成年清洁级健康BrownNorway大鼠,开胸,取心脏,在4℃冷室内将心脏置于冷饱和氧的无钙台氏液中用眼科剪进行修剪。将心脏分装于离心管内,15000转离心15mins,弃掉上清,分别加入标准液和10%的Triton X-100,冰上静置45mins后,15000转离心15mins,弃掉上清,再分别加入2ml的标准液,15000转离心15mins,弃掉上清,此时,四个离心管中加入250μL的标准液,将沉淀与标准液充分混匀后,移入一个离心管中,制备成1ml保有正常活性的心肌肌丝。(2)肌丝横桥Mg2+-ATPase功能的检测取96孔板,依照钙离子浓度梯度加入EGTA+Ca2+溶液作为Mg2+-ATPase反应的底物,最后加入HPLC水作为对照组,向EGTA/Ca2+溶液中加入肌丝40μL,充分混匀,盖上96孔板的盖子,于31℃在PCR仪上预孵育10mins,用12头的联排枪向肌丝/EGTA溶液中加入20μL 7mM的ATP,充分混匀,孵育10mins,后加入100μL终止液,移至室温,1 Omins后,加入100μL显色液,静置30mins后,在650nm的分光光度仪下,检测Mg2+-ATPase的反应情况,通过标准曲线得出麻醉药对肌丝Mg2+-ATPase功能的作用。结果1.异丙酚改变Trebeculae肌条收缩力但没有影响肌条内钙离子浓度加入不同浓度异丙酚,10min后发现,随着异丙酚浓度的升高,心肌Trebeculae肌条的收缩力也逐步降低,与此同时,本研究通过检测Trebeculae肌条内钙离子浓度的变化,发现,临床浓度的异丙酚并没有降低细胞内钙离子的浓度,而高浓度的异丙酚则显著降低肌条内钙离子浓度。2.异丙酚影响全细胞功能状态下Trebeculae肌条的持续收缩力对照组中,随着肌条内钙离子浓度的升高,心肌收缩力显著上升,于50μM的异丙酚预处理后发现,随着肌条内钙离子浓度的升高,同对照组相比,心肌收缩力显著降低。与对照组相比,异丙酚组全细胞功能状态下,其最大收缩力与50%收缩力时对应的钙离子浓度都显著升高,两曲线趋势没有变化,但伴随着曲线整体右移,说明心肌对钙离子的敏感性明显降低。3.异丙酚对心肌肌丝的收缩作用对照组中,随着肌条内钙离子浓度的升高,心肌收缩力显著上升。50μM的异丙酚预处理30mins后发现,随着肌条内钙离子浓度的升高,同对照组相比,心肌收缩力显著降低。心肌肌丝对钙离子敏感性显著降低。4.异丙酚影响肌丝横桥Mg2+-ATPase的活性对照组中,随着肌条内钙离子浓度的升高,心肌收缩力显著上升,50μM的异丙酚预处理后发现,随着肌条内钙离子浓度的升高,同对照组相比,Mg2+-ATPase的活性显著降低。结论临床剂量的异丙酚可以显著抑制心肌收缩功能,上述作用与其降低心肌钙离子敏感性相关,异丙酚对心肌肌丝钙离子敏感性的抑制作用介导了其降低心肌收缩功能的部分机制。第二部分 异丙酚抑制脂多糖诱导的,NADPH氧化酶调节的巨噬细胞肿瘤坏死因子-α和白介素-6的分泌目的本研究以RAW264.7巨噬细胞系为研究对象,研究LPS刺激时,异丙酚抑制巨噬细胞分泌TNF-a和IL-6的具体机制。首先,通过Elisa检测异丙酚对巨噬细胞TNF-a和IL-6释放的影响,并用Western Blot检测NF-κB的磷酸化,接着通过DHE染色技术,直观的反映出异丙酚对ROS含量的影响,最终通过对NADPH氧化酶的活性和含量的检测,将本研究集中于异丙酚对LPS诱导的巨噬细胞内NOX2/ROS/NF-κB信号通路上。方法1. RAW 264.7细胞的复苏、换液及传代将储存于液氮的RAW264.7细胞复苏,新鲜DMEM培养基呈红色,培养基变黄,须更换培养液。待巨噬细胞铺满培养瓶,弃去瓶内培养基,将细胞系分别接种于几个新的培养瓶中继续培养,每2-3天传代一次。2.细胞因TNF-α和IL-6子的测定将巨噬细胞接种于96孔板内,按照Elisa试剂盒(购于Endogen)的操作步骤,以空白调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值),以OD值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度,以表明异丙酚对巨噬细胞IL-6和TNF-α分泌的影响。3.实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测TNF-a和IL-6 mRNA的表达提取总RNA并合成cDNA,构建TNF-α(?)IL-6的表达引物,实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测。4. Western Blot检测巨噬细胞内NF-κB和Akt的激活提取巨噬细胞的总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,SDS-PAGE蛋白电泳检测总蛋白及磷酸化蛋白。5.DHE染色法检测巨噬细胞内超氧化物的含量巨噬细胞分别用DMSO和50gM的异丙酚预处理40min,然后加入LPS(100ng/ml)至培养基中。在荧光显微镜下观察巨噬细胞内ROS含量变化。6. NADPH氧化酶活性的测定将巨噬细胞接种于24孔板内,过夜培养。分别用DMSO和50μM的异丙酚预处理40min,然后加入LPS至培养基中。设定好分光光度仪,设置空白对照孔,计算NADPH氧化酶的活性。7. Western Blot检测异丙酚对巨噬细胞NADPH氧化酶表达的影响提取巨噬细胞的总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,SDS-PAGE蛋白电泳检测总蛋白及磷酸化蛋白。结果1.异丙酚影响LPS诱导的巨噬细胞TNF-a和IL-6的分泌在未处理的巨噬细胞中,TNF-a和IL-6的含量很低,但加入LPS后,细胞因子的分泌量显著增加,不同浓度的异丙酚(10,50, and 100μM)对巨噬细胞分泌功能的抑制作用也是随着浓度的升高而增强,分别降低了20.01±5.4%(P<0.05),46.15±6.8%(P<0.05)和61.53±10.2%(P<0.05)。2.异丙酚影响LPS诱导的巨噬细胞TNF-a和IL-6 mRNA的表达在未处理的巨噬细胞中,TNF-α和IL-6的mRNA表达量很低,加入LPS后,细胞因子TNF-a和IL-6的mRNA表达量显著增加,临床剂量(50μM)的异丙酚可以显著抑制巨噬细胞mRNA的表达,只加入异丙酚对巨噬细胞TNF-a和IL-6的mRNA表达没有明显影响。3.异丙酚影响LPS诱导的巨噬细胞NF-κB和Akt的磷酸化在未处理的巨噬细胞中,NF-κB和Akt蛋白的磷酸化程度很低,加入LPS(100 ng/mL) 1h后,NF-κB和Akt蛋白的磷酸化程度明显升高,而临床剂量(50μM)的异丙酚可以显著抑制巨噬细胞NF-κB和Akt蛋白的磷酸化,只加入异丙酚对巨噬细胞NF-κB和Akt蛋白的磷酸化没有明显影响。4. NF/κB抑制剂PDTC对LPS诱导的巨噬细胞TNF-a和IL-6分泌及表达的影响在未处理的巨噬细胞中,巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌及表达程度很低,加入LPS (100 ng/mL) 1h后,TNF-a和IL-6的分泌及表达程度明显升高,而用20μM的PDTC预处理1h后,可以显著抑制巨噬细胞TNF-a和IL-6的分泌及表达,只加入PDTC对巨噬细胞细胞因子的分泌及表达没有明显影响。5.异丙酚影响巨噬细胞内超氧化物的产生在未处理的巨噬细胞中,巨噬细胞ROS的含量很低,加入LPS(100ng/mL) 40min后,ROS的含量明显升高,而用50μM的异丙酚预处理40min后,可以显著抑制巨噬细胞ROS的生成,只加入异丙酚对巨噬细胞ROS的生成没有明显影响。6.异丙酚影响NADPH氧化酶的活性在未处理的巨噬细胞中,巨噬细胞NADPH氧化酶的活性很低,加入LPS(100 ng/mL) 6h后,NADPH氧化酶的活性明显升高,而用50μM的异丙酚预处理40min后,可以显著抑制巨噬细胞NADPH氧化酶的活性,只加入异丙酚对巨噬细胞NADPH氧化酶的活性没有明显影响(见图6)。7.异丙酚影响巨噬细胞NADPH氧化酶gp91phox和p47phox亚基的合成有研究证实,异丙酚可以抑制血管内皮细胞内的NADPH氧化酶亚基的合成,本研究以上结果提示,异丙酚也极有可能抑制巨噬细胞内NADPH氧化酶的亚基,为证实此设想,我们通过Western Blot技术测定了巨噬细胞内关键作用的三类亚基(p22phox亚基,gp91phox和p47phox)的含量变化。加入LPS (100 ng/mL) 8h后,NADPH氧化酶三类亚基的含量明显升高,而用50μM的异丙酚预处理40min后,可以显著抑制巨噬细胞NADPH氧化酶gp91phox和p47phox亚基的含量,而对p22phox亚基没有明显影响,只加入异丙酚对巨噬细胞NADPH氧化酶三类亚基的含量没有明显影响。结论异丙酚可以显著抑制巨噬细胞细胞因子TNF-α和IL-6的分泌,异丙酚的上述作用与其对巨噬细胞内ROS和NF-κB的活化抑制相关,异丙酚通过抑制NADPH氧化酶活性及p47phox、gp91phox两亚基表达介导巨噬细胞TNF-α和IL-6分泌的部分机制。