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以胰岛素为模型药物,研究了胰岛素的PEG化以及PEG化胰岛素的物理化学性质和生物活性,并以互穿网络超多孔水凝胶（SPH-IPN）为药物载体,研究了口服PEG化胰岛素的降血糖作用。1 PEG的活化采用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法对单甲氧基聚乙二醇（MPEG5000）进行活化,分别制备了单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯（MPEG5000-SS）和单甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯（MPEG5000-SCM）两种活性酯衍生物。比色法测定两种衍生物的活化度均超过90%。MPEG-SS和MPEG-SCM的红外光谱都具有以下特征峰:1740 cm-1处为活性酯羰基的伸缩振动峰,1785 cm-1附近和1813 cm-1处分别为琥珀酰亚胺分子中两个羰基的伸缩振动峰。核磁共振分析结果表明两种衍生物均具备各自的特征基团。2 PEG化胰岛素的制备采用合成的MPEG5000-SS和MPEG5000-SCM对胰岛素进行随机修饰。以MPEG5000-SS为例,用三硝基苯磺酸（TNBS）比色法分析PEG化胰岛素混合物的平均修饰程度,SDS-PAGE分析联结不同数目PEG链的胰岛素组分分布,以平均修饰度和混合物的组分分布情况为考察指标,分别研究了反应溶剂、原料配比和反应时间对胰岛素PEG化合成的影响,确定了本文胰岛素PEG化的合成工艺:将适量胰岛素溶解于DMF/0.1 mol·l-1pH 7.4硼酸盐缓冲液（60:40,v/v）混合溶剂中,制得浓度在1-10 mg·ml-1范围内的胰岛素溶液。按照胰岛素/MPEG-NHS活性酯为1:5（mol/mol）的配比投入MPEG-NHS活性酯固体粉末,室温下搅拌反应4 h。加入相当于MPEG5000-NHS活性酯2倍摩尔量的6-氨基正己酸溶液终止反应。反应混合液对0.01%的NH4HCO3溶液进行彻底的透析,冷冻干燥,制得PEG化胰岛素混合物。采用Sephadex G75凝胶过滤色谱,Protein-PakTM SP 8HR阳离子交换色谱和C18反相高效液相色谱分离PEG化胰岛素。结果表明:Sephadex G75凝胶过滤色谱可以有效去除PEG化胰岛素混合物中未反应的胰岛素和小分子杂质,但不能将PEG化胰岛素按修饰度不同而逐一分离。而SP阳离子交换色谱和C18反相高效液相色谱都能够将PEG化胰岛素按修饰度不同而逐一分离。阳离子交换色谱各组分的洗脱顺序为,较高修饰度PEG化胰岛素先于较低修饰度PEG化胰岛素洗脱出来,胰岛素最后洗脱出来。而在C18反相高效液相色谱中,胰岛素最先洗脱出来,而较高修饰度PEG化胰岛素后于较低修饰度PEG化胰岛素洗脱出来,刚好与PEG化胰岛素经阳离子交换色谱分离的洗脱顺序相反。在上述分离工作的基础上,先后采用SP Sepharose阳离子交换色谱和QSepharose阴离子交换色谱分离纯化PEG化胰岛素,得到三种不同修饰度的PEG化胰岛素。三种PEG化胰岛素的纯度经RP-HPLC检测均在90%以上。3 PEG化胰岛素的表征采用非还原SDS-PAGE法和MALDI-TOF MS法测定单,双和三修饰PEG化胰岛素的分子量。SDS-PAGE测出三种PEG化胰岛素的表观分子量分别为11.1,23.5和35.0 KDa,除了单修饰PEG化胰岛素的表观分子量比较接近其实际分子量（10.8 KDa）外,双、三修饰PEG化胰岛素的表观分子量都大于其实际分子量（15.8和20.8 KDa）。MALDI-TOF MS测得的单、双修饰PEG化胰岛素的分子量分别为10.8 KDa和15.9 KDa,与实际分子量相符。MALDI-TOF MS未能检出三修饰PEG化胰岛素的分子量。三种PEG化胰岛素的紫外吸收光谱和胰岛素相比差异较小,在220 nm和275 nm附近均有吸收峰。通过测定275 nm处的吸光度值计算三种PEG化胰岛素溶液的浓度,将PEG化胰岛素的浓度以胰岛素浓度计。PEG化胰岛素的圆二色谱分析表明,胰岛素的PEG化不会对胰岛素的高级结构造成影响。PEG化胰岛素的自缔合受到一定程度的抑制,其自缔合状态随PEG化程度的提高而减少。采用加速振荡实验研究了胰岛素和三种PEG化胰岛素的物理稳定性。在37℃,200 rpm的加速振荡条件下,胰岛素分子发生纤维化反应,在12 h内基本沉淀完全。PEG化胰岛素的纤维化反应受到抑制,1PEG-insulin的物理稳定性至少是胰岛素的17倍。而2PEG-insulin和3PEG-insulin经过加速振荡24天时,溶液中样品含量仍保持在初始值的80%以上,物理稳定性远大于胰岛素和1PEG-insulin。胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶对胰岛素和三种PEG化胰岛素的体外酶解试验表明,胰岛素的PEG化能够在一定程度上抑制三种蛋白酶对胰岛素的降解,而且抑制的程度随PEG化程度的提高而增加。4 PEG化胰岛素体内降血糖作用的研究比较了正常小鼠皮下注射(0.5 U·kg-1)胰岛素和PEG化胰岛素的降血糖作用。胰岛素给药后30 min左右血糖降至低谷,为初始值的26%左右;给药后3 h,血糖回复到初始值的90%以上。1PEG-insulin给药后90 min左右血糖降至低谷,为初始值的52%左右;5 h左右血糖回复到初始水平的90%左右。2PEG-insulin给药后120 min左右血糖降至低谷,为初始值的76%左右;3 h至4 h左右血糖回复到初始水平的90%左右。3PEG-insulin给药后90 min左右血糖降至低谷,仅为初始值的87%左右;2 h内血糖迅速回复到初始血糖水平。以胰岛素为基准,通过比较各给药组降血糖曲线上面积,计算得1PEG-insulin,2PEG-insulin和3PEG-insulin的生物活性分别为天然胰岛素的93%,46%和24%。正常大鼠静脉注射给药降血糖试验结果表明,1PEG-insulin具有明显的降血糖作用,其降血糖作用时间较胰岛素有所延长。2PEG-insulin和3PEG-insulin的活性损失较多,其体内降血糖作用不明显。采用吸附法将1PEG-insulin载入SPH-IPN,载药量达（10.52±0.87）%（wt）。体外释放试验结果表明,1PEG-insulin从SPH-IPN中释放较快,10 min时超过80%的药物被释放。将载有1PEG-insulin的SPH-IPN装于大鼠用普通肠溶胶囊中,大鼠口服给药,产生明显的降血糖作用,8-10 h左右血糖值降至最低,为初始值的65%左右。对照组口服给予胰岛素溶液,1PEG-insulin胶囊或空白SPH-IPN胶囊,均无明显的降血糖作用。以皮下注射(1 U·kg-1)胰岛素的PBS溶液为对照,计算得大鼠口服(40 U·kg-1)载1PEG5000-insulin的SPH-IPN胶囊的相对药理生物利用度为5.1±2.0%。胰岛素的PEG化在尽量不影响胰岛素生物活性的前提下,能够抑制胰岛素单体的自缔合,提高胰岛素的物理稳定性和抵抗蛋白酶降解的能力,延长胰岛素体内降血糖作用的时间,结合SPH-IPN具有的抑酶、促渗及黏膜黏附的作用,能够提高胰岛素的口服生物利用度,是一种较有前景的蛋白质多肽类药物口服给药技术。