白脊藤壶胶蛋白BacP-20K第四段多肽重复序列和突变体的构建,表达和功能分析

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海洋粘附生物能够分泌具有极强粘附力的粘附蛋白粘附于各种材料表面,其所分泌的粘附蛋白具有强度高、耐水好以及抗微生物分解等优点。作为一种常见海洋粘附生物,藤壶有着和其它物海洋粘附生物如贻贝、管虫等不同的粘附机理。贻贝和管虫粘附蛋白中含有DOPA等翻译后修饰现象,而对藤壶粘附蛋白的研究发现其不存在翻译后修饰现象,这为人工合成类似粘附剂提供了可能。  藤壶胶蛋白是多蛋白复合体,由一系列功能相关,协同作用的蛋白质构成。有研究者发展出一种溶解藤壶胶部分蛋白的方法,分析了藤壶胶中可溶成分的蛋白质组成,并根据蛋白质分子大小对其命名。目前研究比较多的是20K蛋白,有研究者通过原核表达方式表达出红巨藤壶(Megabalanusrosa)和白脊藤壶(Balanusalbicostatus)的20K蛋白,并对其结构和功能进行了分析,藤壶胶20K蛋白特异性的粘附于钙质基底和金属表面。分析藤壶胶20K蛋白氨基酸序列,根据保守的半胱氨酸排列,Mrcp-20K可以排列而成六段重复序列,而Bacp-20K可以排列而成四段重复序列。有研究表明Mrcp-20K第五段重复序列可以自组装成网状纳米结构,但是这些重复的序列是否是某些独立的功能单位,以及半胱氨酸在蛋白功能中到底起什么作用依然不太清楚,而这些问题对阐明20K粘附特性甚至藤壶胶的粘附机理都是非常关键的。  本研究主要通过对Bacp-20K第四段多肽进行串联重复,使其形成四段串联重复的序列,称之为R4,同时设计R4对应的半胱氨酸突变体SOR4,对比研究Bacp-20K,R4以及SOR4的结构和功能之间的差异。主要研究内容和结论简述如下:  以Bacp-20K基因序列为模板,PCR扩增得到第四段多肽DNA序列,再通过同尾酶单、双酶切方法串联重复,得到该多肽的串联重复序列。同时化学合成该多肽的半胱氨酸突变体DNA序列,通过同样的方法串联重复成多倍体。将串联重复序列构建到表达载体中进行原核表达,优化诱导表达以及纯化条件得到具备一定纯度的相关蛋白。  对蛋白结构分析发现,R4二级结构以及粘附于云母片上的形貌都和Bacp-20K类似,二者都具有比较紧密的二级结构,且在云母片表面形成较厚的粘附层并形成致密结构。而SOR4则不具有这样的性质,其结构比较疏松,不易粘附于云母片上。对其粘附性能对比分析,R4具有和Bacp-20K同样的甚至更高的粘附性能,SOR4则不具有明显的粘附性能。这证明Bacp-20K四段多肽具有独立的功能,而其中半胱氨酸对蛋白粘附性能的发挥具有是不可替代的作用。
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