前言：β-地中海贫血、镰刀细胞性贫血等血红蛋白疾病是由β-珠蛋白基因单点突变所导致的、全世界发病率最高的遗传病。目前唯一可以根治此类疾病的治疗方法是异体骨髓移植,缺少与患者人类白细胞抗原(HLA)相匹配的骨髓供体极大程度上限制了异体骨髓移植的应用,因此,寻找替代异体骨髓移植的治疗方法极为重要。随着人类对生命科学的深入了解,基因转移技术的研究日益深入,基因治疗成为各种遗传性或获得性疾病治疗的新的希望。自上个世纪九十年代美国第一例基因治疗临床试验开展以来,全世界已开展了超过1800个基因治疗临床试验项目。基因治疗对β-地中海贫血与镰刀细胞性贫血这类单基因突变引起的遗传病的治疗尤为理想。以病人自身的造血干细胞(HSCs)为靶细胞,通过病毒载体或非病毒载体导入正常的β-珠蛋白基因,再将基因修饰后的自体骨髓细胞回输入病人体内,这种结合了基因治疗的自体骨髓移植成为替代异体骨髓移植最有前景的治疗方法。2010年有报道表明,重组慢病毒载体携带正常β-珠蛋白基因在临床试验中在一定程度上纠正了患有重型β-地中海贫血病人的贫血症状,但受试病人在可减少输血频率的同时,也出现了癌前基因HMGA2的转录激活[2],因此,慢病毒基因载体的安全性,仍是其在基因治疗应用中最大的隐患。在诸多的病毒载体中,腺相关病毒(AAV)是唯一被美国国立卫生研究院(NIH)及美国食品和药品管理局(FDA)划分在安全级别一级(RG1)的病毒,即不导致任何疾病的病毒载体。其中,由于2型腺相关病毒载体(AAV2)的安全性及其对多种组织细胞的高转导效率,AAV2已被广泛应用于多种疾病基因治疗Ⅰ-Ⅲ期的临床试验,如肺囊性纤维化、血友病B、先天性黑蒙症等。2012年,欧洲药品管理局(EMEA)批准了由荷兰uniQure公司研制与申报的基因药物Glybera的正式上市。该药以AAV为载体,转导脂蛋白脂酶基因以治疗脂蛋白脂酶缺乏症,是全球第一个上市的AAV基因药物。Glybera获准上市,进一步证明了AAV载体的安全性与有效性,AAV介导的基因治疗研究成为目前国际研究热点。然而,AAV2对HSCs的转导效率不够理想,且其他新型AAV血清型如AAV1-AAV10对HSCs的转导效率的研究,目前鲜有报道。在此类疾病基因治疗的前期研究中,小鼠、猴是常用的动物实验模型,但AAV各种血清型对小鼠、猴及人HSCs的转导效率是否存在种属差异性尚无任何报道。最近,本实验室对AAV2外壳蛋白进行定点突变改造,可大幅度提高AAV2对肝脏等组织/细胞的转导效率。但定点突变外壳蛋白是否可以提高AAV对HSCs的转导效率,目前仍是一个空白区域。血红蛋白疾病的基因治疗,不仅仅需要载体对HSCs的高转导效率,还需要载体介导靶基因在红系高效且特异性表达目的蛋白,因此,优化启动子以提高其活性及红系特异性极为关键。对以上问题的深入研究,将有望提高AAV对HSCs的转导效率,并介导目的基因在红系高效特异性表达,有望为此类血红蛋白疾病的基因治疗提供理想载体,为其临床应用提供依据。目的：1.分析AAV对来源于小鼠、猴与人HSCs转导效率的种属差异性,在血清型AAV1-10中,筛选出对人HSCs转导效率最高的AAV血清型,以在实验设计中指导AAV血清型的选择及最佳动物模型的选择；2.对转导人HSCs的最佳血清型的受体/辅受体进行系统筛选与分析,并研究该血清型的整合特性,以明确该最佳血清型对人HSCs高转导效率的机制,并为将来的临床试验提供筛选病人的指标；3.对最佳AAV血清型的外壳蛋白进行单点突变,在体外及体内筛选最佳单点突变型载体,并联合单点氨基酸突变构建双突变型载体,以进一步提高对人HSCs的转导效率；4.优化载体启动子,构建含红系特异性启动子B19p6的双突变型载体以介导红系特异性蛋白表达。方法与结果：1.系统包装携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的AAV1-AAV10载体,体外比较其对来源于小鼠,猴及人的HSCs的转导效率。结果表明：10个血清型中,AAV1对小鼠Sca-1+,c-kit+,lin-细胞的转导效率高于其它血清型,但对人CD34+细胞转导效率较低；AAV6对小鼠Sca-1+,c-kit+,lin-细胞的转导效率并不理想,但AAV6对人CD34+细胞转导效率显著高于其他血清型；而AAV1-10对猴CD34+细胞的转导效率都不理想。说明AAV对HSCs的转导效率存在显著的物种差异性；2.以人红白血病细胞(K562)为细胞模型,通过血清抑制试验、红细胞糖苷竞争实验、肝素竞争实验、成纤维生长因子(bFGF)竞争实验、胰岛素样生长因子1(IGF-1)竞争实验等竞争性抑制实验,与细胞糖基化抑制、磷脂酶A2、唾液酸苷酶、蛋白酶K等细胞处理实验及载体示踪记录实验,对AAV6所介导的高效且长期的蛋白表达机制进行研究。在示踪实验中,应用Cy3标记不同的AAV血清型的外壳蛋白,并应用共聚焦显微镜检查病毒进入靶细胞的情况,结果发现：AAV6进入靶细胞的几率远远高于其他血清型,这可能是其高转导效率的主要原因。除血清以外,红细胞糖苷、肝素、bFGF与IGF-1对AAV6的转导效率无竞争性抑制作用。应用唾液酸酶、磷脂酶A2等对细胞进行预处理对转导效率无显著影响,而用蛋白酶K预处理细胞可降低AAV6的转导效率。3.通过定点突变的方法,将对人CD34+细胞转导效率最高的AAV6外壳蛋白表面的Y252等六个酪氨酸残基(Y)突变为苯丙氨基酸残基(F),并分别包装双链AAV-EGFP载体或单链AAV-mCherry载体,在体外筛选单点突变载体对人CD34+细胞的转导效率。结果发现Y705F等单点突变对人CD34+细胞的转导效率显著高于未突变及其它单点突变载体。本实验室进一步应用包含单点突变的病毒载体转导人CD34+细胞,进行NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl (NOD/SCID)免疫缺陷小鼠异种移植实验,检测这些单点突变载体在体内介导基因的表达情况。结果进一步证实：所构建的包含酪氨酸单点突变的AAV6载体的转导效率显著高于未突变型载体,可介导目的基因长期高效表达。4.结合两个最佳单点突变,构建双突变载体,有望进一步提高载体对人HSCs的高转导效率。同时,构建含非特异性启动子CBAp,及红系特异性启动子B19p6或HS2-pp驱动下的双链AAV-EGFP以及双链AAV-GLuc病毒载体,可对其在体内、体外介导的基因表达情况进行直观的比较与分析。对HSCs在体外进行红系特异性诱导分化,可比较分化前后转导基因在不同启动子驱动下的表达水平以分析启动子的红系特异性。结果表明,与分化前相比,B19p6与HS2-pp启动子驱动下,基因表达分别可以提高30倍与22倍,而CBAp启动子驱动下的基因表达,在诱导前后无显著性差异。5.在NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wj1/SzJ (NSG)小鼠模型中平行比较三种启动子驱动下的未突变型AAV6及双突变型AAV6载体所介导的基因表达水平。该部分研究进行了两次移植实验,第一次将经载体转导的人HSCs移植入NSG小鼠,移植后第3周开始直至第12周进行基因表达水平监控,并于移植后的第12周,处死受体鼠,分离其骨髓细胞及脾脏细胞,检测人细胞的百分比,以确定异种移植是否成功,并进一步检测各种细胞的基因表达水平,以确定基因表达是否局限于红系特异性。同时,将首次移植成功的受体鼠的骨髓细胞再次移植入新的NOD/SCID鼠或NSG小鼠,重复以上检测,继续评估载体介导目的基因的长期表达情况。结果表明,B19p6启动子驱动下的双突变AAV6载体所介导的基因表达水平最高。结论：本研究所构建的B19p6启动子驱动下的包含双突变的AAV6载体为以HSCs为靶细胞的遗传性疾病,尤其是β-地中海贫血或镰刀细胞性贫血等血红蛋白疾病的基因治疗研究提供了安全有效的理想载体,对此类疾病的基因治疗最终走上临床具有潜在的应用价值。创新性说明：1.首次证明了AAV对HSCs的转导效率存在显著的种属差异性。2.首次全面筛选了AAV6的受体/辅受体,证明AAV6的受体为某种N-linked唾液酸覆盖的多糖蛋白,为进一步研究AAV6受体/辅受体提供了丰富的参考信息。3.首次研究了AAV6酪氨酸单点突变型载体对人CD34+细胞的转导效率。构建了DM-AAV6载体,进一步提高了AAV6对人CD34+细胞的转导效率4.首次构建了不同启动子驱动下的双链AAV-Gluc载体,证明了含B19p6启动子的载体可介导目的基因在体内外红系特异性高效表达；结合B19p6启动子与DM-AAV6载体,使构建在AAV包装长度限制内的β-珠蛋白载体成为可能,并有望应用于p-地中海贫血等疾病的基因治疗。