【目的】：　　癫痫是大脑神经元高度同步化异常放电所导致的，以惊厥反复发作为临床特征的一种常见的神经系统疾病。现已证实电压依赖性钠离子通道（VGSC）功能及表达异常与癫痫发病密切相关，其中钠通道基因SCN1A表达水平下降及SCN3A表达水平上升被认为是促进癫痫发生发展的重要原因。生酮饮食（Ketogenic diet， KD）是一种高脂低碳水化合物的饮食疗法，主要用于治疗儿童难治性癫痫。过去多项研究提示， KD可能通过改变脑的能量代谢方式从基因表达调控、离子通道、抗氧化、神经保护、神经递质释放和突触传递等多条途径来调节细胞特性，降低神经网络兴奋性和缓冲样放电，从而起到抗癫痫作用。但其确切的分子机制仍有待于深入研究。　　甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是糖酵解途径中的一个关键酶。现已证实，GAPDH还作为RNA结合蛋白参与其他基因的转录后调控。本研究发现，GAPDH与人和小鼠的SCN1A与SCN3A基因3′UTR区的一个保守区相结合，由此推测GAPDH所介导的钠通道基因表达调控很可能在癫痫及KD抗癫痫机制中发挥重要作用。　　本研究拟通过体外及在体实验探索GAPDH参与调控钠通道基因表达的分子机制及其在惊厥发生及KD抗惊厥中的可能作用，为进一步了解癫痫的发病机制及优化临床诊治措施提供参考依据。　　【方法】：　　1、保守性分析：采用VectorNTI软件对人和小鼠SCN1A与SCN3A基因3′UT R区序列进行对比，获得保守序列。　　2、RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay（RNA-EMSA）：以生物素标记的RNA保守序列作为探针，采用RNA-EMSA实验分析保守序列与细胞浆蛋白结合情况。　　3、RNA Pull-down：采用Pull-down实验分离与保守序列结合的蛋白复合物，并采用液相色谱质谱联用技术（LC-MS/MS）分析复合物的蛋白成员。　　4、Supershift实验：加入蛋白抗体，采用Supershift-EMSA实验进一步验证与CS1相结合的蛋白。　　5、质粒构建：采用T-A克隆技术，构建钠通道基因3′UT R双荧光素酶报告基因表达载体；并以此为模板，采用定点诱变技术，构建缺失保守序列的载体（CS-Del型）。　　6、双荧光报告系统检测：将重组的双荧光素酶表达载体转染至培养细胞，收获并裂解细胞，采用双赢素酶报告基因系统检测报告基因表达活性。　　7、ShRNA敲降（ShRNA knockdown）：从上海吉玛基因公司定制GAPDH特异敲降的ShRNA表达质粒，并转染至培养细胞，采用Western blot分析敲降效果。　　8、mRNA稳定性分析：放线菌素D处理培养细胞，分别在0、3、5小时时间点，提取细胞总RNA，采用qRT-PCR检测报告基因mRNA水平。　　9、惊厥动物模型构建及KD处理：采用注射海人酸方法构建惊厥小鼠模型，待观察到惊厥表现后，部分小鼠喂食KD饲料。　　10、β-Hydroxybutyric acid（BHB）处理：使用5 mM的BHB处理细胞，分析处理后GAPDH及钠通道基因表达情况。　　11、蛋白免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：采用免疫沉淀技术纯化组织及细胞中的GAPDH蛋白。　　12、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：用于检测组织及细胞的相关基因mRNA表达水平。　　13、蛋白磷酸化检测：使用Phospho-PKC抗体，在Western blot实验检测组织及细胞的GAPDH蛋白Thr-244位点磷酸水平。　　【结果】：　　1、保守性分析发现，人及小鼠的SCN1A和SCN3A基因3′UTR存在3个共同保守区（分别命名CS1、CS2和CS3）；RNA-EMSA证实，只有CS1能特异性结合细胞浆蛋白；进一步采用Pull-down联合SDS-PAGE实验发现，与CS1结合的蛋白复合物分子量大约为35-40kDa；LC-MS/MS测序及Surper-shift EMSA证实，GAPDH与CS1相结合。　　2、报告基因检测结果显示，SCN1A基因3′UTR中CS1的缺失能显著性增强报告基因表达活性，而SCN3A基因3′UTR中CS1的缺失对报告基因表达活性没有影响；当敲降GAPDH表达时，可增强含SCN1A基因3′UTR的报告基因表达，而下调含SCN3A基因3′UTR的报告基因表达，对含有缺失CS1的SCN1A、SCN3A基因3′UTR的报告基因表达均无影响；进一步分析GAPDH对报告基因mRNA稳定性分析发现，GAPDH敲降导致含SCN1A基因3′UTR的报告基因mRNA稳定性增强，而含SCN3A基因3′UTR的报告基因mRNA稳定性减弱。上述结果提示：GAPDH可通过与CS1元件影响mRNA稳定性来下调SCN1A基因表达，上调SCN3A基因表达。　　3、与正常小鼠相比较，惊厥小鼠海马组织中Scn1a的mRNA表达下调，而Scn3a的mRNA表达上调，GAPDH表达上调；与正常饮食的惊厥小鼠相比较，KD饮食的惊厥小鼠Scn1a表达上调，而Scn3a表达水平下调，同样GAPDH表达下调。这些结果提示在惊厥及KD条件下，GAPDH很可能参与Scn1a和Scn3a基因的表达改变。　　4、通过纯化小鼠海马组织G APD H并进行磷酸化检测发现，与正常小鼠相比较，惊厥小鼠GAPDH蛋白Thr-244位点磷酸化水平显著性增加，且与CS1元件结合能力增强，而在KD饮食的惊厥小鼠中GAPDH磷酸化水平回复到正常小鼠水平，与CS1结合能力减弱；进一步体外实验证实，GAPDH去磷酸化后影响到蛋白与调控元件的结合。上述结果表明：在惊厥及KD条件下，GAPDH磷酸化修饰很可能参与Scn1a和Scn3a基因的表达改变。　　5、为了进一步证实KD在调控钠通道基因中的作用，本研究体外分析了KD的一种代谢产物BHB对GAPDH及钠通道表达的影响。在BHB处理的　　N1E-115细胞中，GAPDH表达下调，GAPDH蛋白Thr-244位点发生去磷酸化，并且BHB处理N1E-115细胞中表达的GAPDH对CS1结合能力下降；同样， BHB可导致Scn1a表达上调和Scn3a表达下调。双荧光素酶报告基因活性检测结果显示：BHB可增强含Scn1a基因3′UTR的报告基因表达，而下调含Scn3a基因3′UTR的报告基因表达。上述结果证实：BHB通过下调GAPDH及其去磷酸化来调控钠通道基因的表达。　　【结论】：　　本研究证实GAPDH可通过与钠通道基因3′UTR的保守序列相结合，调控其mRNA稳定性，在转录后水平上负性调控SCN1A表达而正性调控SCN3A表达。在惊厥条件下，GAPDH表达上调及发生Thr-244磷酸化致其与钠通道基因调控元件结合能力增强，从而下调Scn1a基因表达，并上调Scn3a基因表达；而KD处理后可回复这一系列过程。本研究首次揭示了GAPDH参与调控钠通道基因表达及其在惊厥发生及KD抗惊厥中的作用机制，为进一步理解癫痫发病机制及优化临床诊治措施提供参考依据。