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目的近年来胰腺癌发病率在国内外均呈稳固上升趋势,且预后极差,五年生存率仅为3%。尽管外科手术和化疗有了很大的改进,但近20年来胰腺癌患者的预后并未有明显的改善,可手术切除的患者生存率仅为17%。因此,更加全面深入地了解胰腺癌的发病机制,探索有效的治疗靶点意义重大。许多资料显示胰腺癌组织中缺氧诱导因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的表达与预后密切相关,其蛋白表达强弱与淋巴结转移及临床分期等正相关；另外,细胞骨架蛋白编码基因Fascin在细胞迁移及黏附中发挥重要作用。前期研究我们发现,Fascin在正常胰腺细胞中不表达而在胰腺癌细胞中过表达,但Fascin是否促进胰腺癌侵袭转移及其可能的分子机制尚未阐明。结合我们近期发现：Fascin与缺氧诱导因子HIF-1α在胰腺癌组织中表达正相关,且HIF-1α可能直接调控Fascin的表达,而Fascin又可以反向调节HIF-1α的表达。以上发现使我们推测HIF-1α与Fascin之间存在正反馈环路,介导胰腺癌细胞的侵袭转移。本课题组拟在前期工作基础上,从细胞水平研究Fascin与HIF-1α的正反馈环路调控机制及其环路中的Fascin在胰腺癌细胞侵袭转移中的作用。本研究将丰富对Fascin基因的功能认识,为胰腺癌侵袭转移的研究提供新的靶点。方法一、Fascin与HIF-1α在胰腺癌组织中的表达情况1.利用免疫组化方法检测Fascin和HIF-1α在胰腺癌组织中的表达,并初步分析两者表达是否具有相关性二、明确HIF-1α对Fascin表达的影响及其调节机制1.采用1%O2、5%CO2、94%N2混合气体培养细胞作为乏氧培养条件,并利用细胞转染和小RNA干扰技术下调HIF-1α的表达后,分别应用Western blot和RT-PCR检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、VEGF、Fascin及内参β-actin蛋白和基因的表达情况,其中VEGF作为阳性对照。2.应用过表达HIF-1α载体转染胰腺癌细胞,应用Western blot和RT-PCR检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、VEGF、Fascin及内参β-actin蛋白和基因的表达情况,其中VEGF作为阳性对照。3.采用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)明确转录因子HIF-1α与Fascin启动子区的结合情况。4.应用过表达HIF-1α载体、Fascin基因启动子荧光素酶表达载体或其突变体,共同转染胰腺癌细胞,应用双荧光素酶实验分析HIF-1α调控Fascin基因转录激活的能力。三、明确Fascin对HIF-1α表达的影响及其调节机制1.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞,改变Fascin的表达后,应用、Vestern blot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、Fascin及内参β-actin蛋白的表达情况。2.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞,改变Fascin的表达后,应用Western blot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α上游的几条信号通路的激活情况,包括AKT、ERK及p38。3.利用过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞,同时加入某个信号通路的抑制剂,分别应用Western blot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、Fascin及内参β-actin蛋白的表达情况。四、明确Fascin对胰腺癌细胞侵袭能力的影响及其调节机制1.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞,改变Fascin的表达后,应用Transwell技术检测不同处理条件下胰腺癌细胞的侵袭能力。2.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞,改变Fascin的表达后,应用Western blot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的与侵袭有关的MMP-9、 MMP-2以及EMT相关的几个蛋白表达情况。3.利用过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞,同时加入某个信号通路的抑制剂,分别应用Western blot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的与侵袭有关的MMP-9、 MMP-2以及EMT相关的几个蛋白表达情况。结果在胰腺癌组织中,Fascin与HIF-1α表达具有相关性。乏氧信号可以诱导Fascin在mRNA和蛋白水平的表达明显上调,通过RNA干扰技术沉默HIF-1α的表达,可以同时抑制Fascin的表达；深入研究发现,HIF-1α可以结合于Fascin基因启动子区的乏氧反应原件(HRE),并且可以直接上调Fascin启动子区的活性,引起转录激活。通过RNA干扰技术沉默Fascin的表达或过表达Fascin载体上调Fascin的表达后,HIF-1α的表达出现同样的改变；进一步研究发现过表达Fascin载体上调Fascin的表达,可以导致PKC的活性增强,进而导致ERK通路的活化,引起HIF-1α表达的上调,PKC或ERK通路的抑制剂可以明显抑制过表达Fascin对HIF-1α的正向调节作用。通过RNA干扰技术沉默Fascin的表达或过表达Fascin载体上调Fascin的表达后,胰腺癌细胞的侵袭能力发生明显改变,通过Wetsern blot分析,Fascin可以上调MMP-2的表达,ERK通路的抑制剂可以明显抑制过表达Fascin对胰腺癌侵袭能力和MMP-2表达的正向调节作用。结论HIF-1α可以结合于Fascin的启动子区,激活Fascin转录进而导致Fascin的表达上升；Fascin的表达上升可以通过活化PKC导致ERK通路的活化,反向导致HIF-1α的表达上调,从而形成了一个正反馈环。其结果是导致了下游的MMP2表达的上调,进而使胰腺癌细胞的侵袭能力不断累积上升。