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自2010年以来,新发鸭坦布苏病毒（TMUV）病在我国广泛流行,给我国鸭养殖业造成了巨大的经济损失。鸭TMUV同其它蚊媒黄病毒属病毒,如日本乙型脑炎病毒（JEV）和西尼罗病毒（WNV）一样,能够不以蚊虫作为媒介直接在动物间传播。但是,到目前为止,这些病毒脱离蚊媒直接在动物间传播的分子基础尚不清楚。当前流行的鸭坦布苏病毒FX2010能够在鸭子各脏器组织中复制,并且能在鸭间高效传播;而早期蚊源坦布苏病毒MM1775可以在鸭子部分脏器中复制,但不能在鸭间传播。为了了解黄病毒属病毒直接在动物间传播的分子基础,本研究利用坦布苏病毒反向遗传技术对FX2010和MM1775的E蛋白进行相互替换,拯救得到两株E蛋白嵌合病毒:FX/MME和MM/FXE。将嵌合病毒和各自的亲本毒分别接种DF-1细胞,每隔12h测定接种细胞上清的病毒滴度,发现E蛋白替换后,并不影响病毒在DF-1细胞上的复制能力。将病毒经肌肉接种鸭子后第3天,与FX2010相比,FX/MME仍然可以在接种鸭的脾脏、肾脏和卵巢中检测到,但是没有在肺脏中检测到;与MM1775相比,MM/FXE可以在接种鸭肾脏、肺脏中检测到,说明E蛋白影响TMUVs在鸭体内的组织嗜性。另外,利用阻断ELISA方法检测同居接触组鸭子血清,发现包含FX2010 E蛋白的病毒（FX2010和MM/FXE）接触鸭在接触后第7天,血清已经全部转为TMUV阳性,而包含MM1775 E蛋白的病毒（MM1775和FX/MME）接触鸭直到接触后第14天,血清仍然为TMUV阴性,说明E蛋白影响TMUVs在鸭间的传播能力。将E蛋白分为两个不同的区域（EDI&II和EDIII&Th）,拯救相应的嵌合病毒后进行鸭子试验,发现EDI&II是影响TMUV在鸭体内复制能力和在鸭间传播能力的关键区域。进一步,又证明了DI是影响病毒在鸭体内组织嗜性和鸭间传播能力的关键结构域。由于FX2010和MM1775的EDI存在9个氨基酸差异位点,我们以FX2010为背景,对这9个点进行单点突变,拯救得到9株突变病毒,发现第156位丝氨酸突变为脯氨酸（S156P）,导致病毒在鸭体内的复制能力降低,同时造成病毒丧失在鸭间传播的能力。在此基础上,利用Western blotting证明S156P突变破坏了TMUV的E蛋白第154位（N154）糖基化修饰。对NCBI上现有的其它几种黄病毒属病毒的E蛋白氨基酸序列分析发现除了黄热病病毒（YFV）之外,其他绝大多数黄病毒属病毒的E蛋白都具有N154（或N153）糖基化位点,该糖基化位点可能与黄病毒属病毒在自然宿主鸟类间的传播相关。前期工作发现在小鼠上,MM1775和FX2010的致病性强弱与对鸭子的致病性强弱表现完全相反,经鼻腔接种,MM1775可以致死小鼠,而FX2010不引起小鼠发病。为了研究导致这一差异的分子基础,利用反向遗传操作系统拯救E蛋白相互替换嵌合病毒,经鼻腔感染3周龄Balb/c小鼠,发现E蛋白替换后,MM/FXE丧失了致死小鼠的能力;而FX/MME获得了致死小鼠的能力,说明E蛋白是影响TMUVs对小鼠致病力的关键蛋白。为了进一步明确E蛋白中决定对小鼠致病性差异的关键区域,将E蛋白分为4个部分:E蛋白结构域I（DI）、结构域II（DII）、结构域III（DIII）和跨膜螺旋区（Th）,分别以MM1775和FX2010为背景,将4个区域上的差异氨基酸位点分别进行相互突变,拯救得到8个单区域替换病毒。经鼻腔接种3周龄Balb/c小鼠,与亲本毒MM1775相比,MM/FXE-DI和MM/FXE-DII都不能进入小鼠脑内复制,也不致死小鼠;而MM/FXE-DIII和MM/FXE-Th与MM1775相似,均可以在接种后第4天和第6天的小鼠脑内检测到,可以致死小鼠;与亲本毒FX2010相比,经鼻腔感染,FX/MME-DI获得进入、并在脑组织脑中复制的能力,同时获得致死小鼠的能力;但是FX/MME-DII、FX/MME-DIII和FX/MME-Th与FX2010一样,都没有在接种小鼠脑中检测到,感染小鼠没有发病,说明EDI是影响TMUVs对小鼠致病性的关键结构域。进一步,对MM1775 EDI上与FX2010存在的9个差异氨基酸位点进行单独突变,拯救得到9株突变病毒,经鼻腔接种3周龄Balb/c小鼠,发现MM1775E蛋白第149位缬氨酸突变为丙氨酸（V149A）、第156位脯氨酸突变为丝氨酸（P156S）和第181位甘氨酸突变为谷氨酸（G181E）都能降低病毒对小鼠的致病力。其中,MM-EV149A和MM-EP156S接种后第4天和第6天,分别在1只小鼠的脑中检测到病毒,但滴度较低,小鼠存活率分别为80%和100%,MM-EG181E接种后第4天和第6天没有在小鼠的脑中检测到病毒,也没有引起小鼠发病,小鼠存活率为100%。为了研究氨基酸突变是否影响病毒在小鼠脑组织中的复制能力,将这3株突变病毒及其亲本毒MM1775经脑内接种5周龄Balb/c小鼠,结果发现V149A和G181E突变降低了病毒在小鼠脑内复制的能力,与亲本毒MM1775相比,MM-EV149A和MM-EG181E对小鼠的半数致死量均升高了30倍以上;MM-EP156S脑内接种后第4天,没有在小鼠脑中检测到,但是第6天和第8天在脑组织中病毒滴度较高,而且对小鼠的半数致死量与MM1775相同。本研究明确了决定TMUV在鸭体内组织嗜性和直接在鸭间传播的分子基础,为阐明黄病毒属病毒在动物间直接传播提供了病毒模型和理论依据。另外,确定了TMUV对小鼠的致病性差异的分子基础,为进一步研究TMUV对哺乳动物的致病机理奠定了基础。