论文部分内容阅读
研究背景和目的：临床研究表明亚低温疗法(32-34℃)在中风、脑损伤、心脏骤停等多种疾病中具有显著的保护作用。而血管内皮与许多病理过程的发生发展关系密切。然而,迄今为止,亚低温在各种原因引起的内皮细胞损伤中能否起到保护作用以及其中的作用机制尚不明确。因此,本研究拟探讨亚低温在肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)引起的内皮细胞屏障功能紊乱和凋亡中的作用及其中的分子机理。实验方法：用TNF-α处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),再分别放置于正常温度(37℃)和亚低温(33℃)培养箱中培养2-6小时。用异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)体外通透性实验检测单层内皮细胞的通透性、用罗丹明标记的鬼笔环肽染色法检测细胞内纤维状的肌动蛋白(F-肌动蛋白)骨架、用原位末端标记(terminal dUTP nick-end labeling, TUNEL)染色法检测细胞的凋亡。用免疫印记(western blot)法检测半胱氨酸蛋白水解酶-3片段(Cleaved caspaspe-3, Asp175)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、热休克蛋白27 (heat shock protein 27, HSP27)、c-Jun、MAPK激酶3/6 (MAPK kinase3/6, MKK3/6)、MAPK激酶7 (MAPK kinase7, MKK7)和MAPK磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1, MKP-1)的蛋白表达；另外,用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580或者JNK特异性抑制剂SP600125预处理HUVECs,再进行TNF-α处理,并对上述各项指标进行检测；同时,将HUVECs不加任何刺激剂放置于亚低温培养箱中培养,再检测MKP-1的蛋白水平和mRNA水平以及p38 MAPK和JNK的蛋白表达；最后用MKP-1的siRNA转染HUVECs,再进行TNF-α处理,同时检测各项指标。实验结果：(1)TNF-α处理引起单层HUVECs通透性显著增强、细胞肌动蛋白骨架重排、和凋亡发生,而亚低温能显著抑制TNF-α引起的这些内皮损伤效应。(2)亚低温抑制TNF-α活化的p38 MAPK和JNK信号通路。(3)亚低温通过抑制p38 MAPK/HSP27信号通路减弱TNF-α引起的内皮细胞肌动蛋白骨架的重排和压力纤维的形成。(4)亚低温对内皮细胞凋亡的保护作用是通过抑制p38 MAPK和JNK信号通路而实现的。(5)亚低温对p38 MAPK和JNK的上游激酶MKK3／6和MKK7无明显影响,但可显著上调p38 MAPK和JNK的上游磷酸酶MKP-1。(6) siRNA实验表明,亚低温通过诱导MKP-1的表达抑制TNF-a引起的p38MAPK和JNK信号通路的激活以及内皮细胞屏障功能紊乱和凋亡结论：亚低温通过诱导MKP-1的表达,抑制TNF-a引起的p38 MAPK和JNK信号通路的激活,从而保护TNF-a引起的内皮细胞屏障功能紊乱和凋亡。