论文部分内容阅读
Mx蛋白是由I型干扰素诱导宿主细胞所产生的一种抗病毒蛋白质，该蛋白属于GTP酶活性的动态蛋白超家族成员之一。Mx蛋白具有广谱的抗病毒活性，目前已相继发现了鼠、人、牛、羊、鱼等不同物种的Mx蛋白，并检测到其对流感病毒（Influenzavirus,IV）、水疱性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus,VSV）、托高土病毒（Thogotovirus）及乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）等多种RNA病毒与少数DNA病毒增殖的抑制作用。口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）是国际兽医局（OIE）规定的A类动物病原微生物之一，能引起偶蹄动物口蹄疫。该病具有高度传染和持续性感染的特性，对偶蹄动物的健康和生产性能危害极大，严重威胁畜牧业的发展。研究发现，I型干扰素对多种病毒的复制具有较强的抑制作用，是脊椎动物抵抗病毒感染的一道重要防线。已经有研究证明，I型干扰素主要依赖其诱导的抗病毒蛋白2’，5’-寡腺苷酸合成酶（OAS-1）和蛋白激酶（PKR）对FMDV的复制产生抑制作用。Mx蛋白是随后发现的由I型干扰素诱导的第三种抗病毒蛋白，该蛋白在机体抗FMDV感染中的作用目前尚不清楚。为了证实牛Mx1蛋白是否具有抗FMDV活性，本研究克隆了牛Mx1基因，将其定向插入原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达，获得了重组牛Mx1融合蛋白，免疫小鼠后制备了抗牛Mx1蛋白特异性抗体；构建了pcDNA3.1/bMx1真核表达载体，将真核表达载体转染BHK-21细胞，经过G418筛选，获得了稳定表达牛Mx1蛋白的重组BHK-21细胞株，并在该细胞株上检测了牛Mx1蛋白抗FMDV活性。研究方法和主要结果如下：1.牛Mx1基因的克隆、原核表达及其抗体制备：采用RT-PCR方法从中国荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增出牛Mx1基因，扩增产物经KpnI、XhoI双酶切后插入原核表达载体pET-32a（+）中；对构建的重组质粒pET-32a/bMx1进行PCR、酶切和测序鉴定后，将其转化至工程菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹（Westernblot）分析；用Ni柱纯化融合蛋白，将纯化的蛋白加佐剂后免疫小鼠，制备抗血清，琼扩试验检测抗体效价。结果成功克隆了牛Mx1基因编码区，构建了牛Mx1基因原核表达载体pET-32a/bMx1；转化后的BL21（DE3）在28℃、1.0mmol/LIPTG浓度条件下诱导6h时，SDS-PAGE分析发现在相对分子质量约90kDa的位置出现预期大小一致的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白量的28%；Westernblot检测到表达的牛Mx1重组蛋白能与牛Mx1蛋白抗体特异性结合；琼扩试验检测，牛Mx1融合蛋白免疫小鼠后制备的抗血清效价为1∶32。2.稳定表达牛Mx1蛋白的BHK-21细胞株的构建及鉴定：将牛Mx1基因cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）；通过脂质体将构建好的真核表达载体pcDNA3.1/bMx1和空载体pcDNA3.1（+）转染至BHK-21细胞，并用G418筛选；筛选出的阳性细胞经PCR、RT-PCR、Westernblot及间接免疫荧光（IFA）从分子、蛋白水平鉴定牛Mx1基因在细胞中的表达；传20代后再次用PCR、RT-PCR检测其遗传稳定性。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/bMx1，筛选出的阳性细胞与正常细胞相比形态与生长速度无差别；PCR、RT-PCR均扩增出约1947bp目的片段；Westernblot约在75kDa处检测到一条特异性蛋白条带，与预期大小相符；IFA结果显示实验组阳性BHK-21细胞出现了的荧光，而阴性对照组细胞没有荧光的表达；PCR、RT-PCR可以从传20代后的阳性BHK-21细胞中扩增出目的片段。结果提示，牛Mx1基因在构建的重组BHK-21细胞株内获得表达，且具有遗传稳定性。3.牛Mx1蛋白抗FMDV活性分析：用100TCID50O型FMDV感染重组BHK-21细胞，通过实时荧光定量PCR测定攻毒后12h、24h、36h和48hFMDVVP1基因的相对拷贝数；然后测定不同时间点病毒的滴度(TCID50)；用间接免疫荧光（IFA）检测攻毒后20h时FMDV在细胞内的含量。与阴性对照组细胞相比，表达牛Mx1蛋白的重组BHK-21细胞发生病变的时间延迟，细胞病变（CPE）减轻。在攻毒后12h、24h、36h和48h，FMDVVP1基因的相对表达量分别下降了45%、60%、25%、10%；TCID50测定结果显示表达牛Mx1蛋白的重组BHK-21细胞内病毒滴度低于阴性对照组，其中在攻毒后24h时，阴性对照细胞组TCID50是表达牛Mx1蛋白重组BHK-21细胞的10倍左右；IFA检测结果显示表达牛Mx1蛋白重组BHK-21细胞内的荧光量和强度低于阴性对照组。实验结果证实：牛Mx1蛋白能有效抑制FMDV的增殖。本研究成功构建了稳定表达牛Mx1蛋白的BHK-21细胞株，并研究了其抗FMDV活性，为揭示牛Mx1蛋白抗FMDV作用的分子机制及抗FMDV家畜分子育种新材料的研发提供了科学依据。