辽宁兴城油松种子园的油松(Pinus tabulaeformis Carr.)雌性不育株(28号无性系)表现为球果能正常长大,但雌配子体由于游离核有丝分裂不能继续进行而停止发育,导致胚珠败育。该不育系具有稳定的遗传特性,是研究木本植物雌配子体发育调控机制的极好材料。为进一步分析该不育系游离核停止分裂的原因,本论文在系统研究油松28号不育系游离核停止分裂前后细胞形态学和组织化学的基础上,以油松种胚为材料建立了油松悬浮细胞系,采用细胞同步化技术、流式细胞仪技术、蛋白质双向电泳技术等研究手段初步分析了油松细胞周期调控机制;并进一步利用免疫印迹、免疫组化技术探讨了细胞周期相关调控因子在游离核分裂关键时期的表达。研究结果为揭示裸子植物雌配子体发育过程中细胞周期调控因子的表达与调控机制提供了非常有价值的信息,对拓展木本植物发育生物学的研究领域,以及揭示植物雌性不育机制等都具有十分重要的意义。1.利用油松雌配子体分离、电镜观察、细胞组织化学等技术,观察比较了在游离核停止分裂前后油松11号可育系和28号不育系珠被、珠心、雌配子体及游离核的显微结构、超微结构、营养物质的动态变化。发现油松不育系雌配子体发育停止在游离核时期,该时期不育系游离核等细胞器出现异常,细胞核膨大,核仁消失,核内染色质发生汇聚、凝集,在雌配子体细胞质中含有大量的异常线粒体,其形态异常膨大或延长,内部结构模糊不清,而小液泡的数量明显减少,甚至看不到较大的液泡,并且有部分液泡膜出现凹陷或裂解。另外不育系胚珠珠心组织细胞异常加厚,多糖物质出现异常积累。2.油松悬浮细胞细胞周期的研究结果显示,处于指数生长的油松悬浮细胞用3mM HU处理24h后,细胞恢复生长3h时,90.71%的细胞被阻断于G1期,恢复生长27h时,M/A分裂指数达到最大值,并且有40%的细胞进入G2期。分析同步化处理后恢复生长3h和27h的细胞蛋白质组,发现G1期细胞特有蛋白质点11个,M期细胞新增加4个。与G1期相比,M期表达量明显上调的蛋白质点7个,明显下调的蛋白质点3个。差异蛋白质主要分布在18kDa/pI6.3-30kDa/pI7.5和60kDa/pI6.5-70kDa/pI7.2两个区域。推测这些蛋白质可能参与了不同时期细胞周期的调控过程。3. CaM和类Cyclin C蛋白在雌配子体游离核有丝分裂过程中起着重要作用。CaM,类Cyclin C蛋白在油松细胞周期过程中呈现出相似的周期性变化,即G1期含量较少,S期大量积累,到G2期CaM含量有所减少,在下一个细胞周期S期又增加,表明这些因子与油松细胞周期调控有关。CaM和类Cyclin C蛋白在油松胚珠中的分布具有时空调控特征。在游离核旺盛分裂期,珠被大细胞层中CaM的分布明显减少,而外侧珠被组织中CaM的分布明显增加,推测珠被组织可能作为产生或集散CaM的部位,通过钙(Ca2+)信号系统调控了游离核的分裂以及珠心组织细胞的降解;在雌配子体细胞化过程中,雌配子体游离核区CaM含量的增加,推测可能与游离核细胞壁的形成相关。类Cyclin C蛋白伴随着油松雌配子体游离核的旺盛分裂而表达,在败育后期不育系胚珠中类Cyclin C蛋白过度表达,推测可能参与了油松游离核有丝分裂的调控,类Cyclin C蛋白异常表达可能是影响雌配子体育性的重要因素。