研究背景：　　女性盆底功能障碍性疾病（plevic floor dysfunctional deases，PFD），是指各种病因造成的盆底支持结构的缺陷、损伤及功能障碍等造成的疾病，又称盆底缺陷或盆底支持组织松弛,在中老年女性群体的发病率约达到50％及以上，严重影响女性身心健康和生活质量，随着女性寿命延长，人口的老龄化，盆底功能障碍性疾病的发病率将有明显上升趋势，约30%PFD患者需接受盆底修复或重建手术，其中占15%患者需再次的手术干预治疗。　　加用人工合成网片经阴盆底重建手术（transvaginal mesh，TVM）可降低术后复发率，A级证据证明TVM手术可明显降低重度阴道前壁脱垂患者的术后复发率，而对生活质量改善度与传统术式比较差异无统计学意义。但是，TVM手术的人工合成网片带来的术后并发症倍受人们的关注。目前临床上较多采用的网片主要为人工合成材料，以聚乙烯材料为代表，它为解剖复位提供了良好的组织支撑作用,但由于其顺应性较差、有一定的组织侵蚀性、具有较高的网片侵蚀率、感染率、及术后性交痛等相关并发症。而脱细胞处理的生物材料是克服上述相关缺陷，材料植入人体后通过提供屏障促进自身组织胶原组织增生、周围组织移行而形成支撑结构,从而达到支撑盆底的作用，相对于人工合成补片,其优点是组织对其排斥反应低，补片侵蚀率及暴露率低,患者术后性交痛及盆腔慢性疼痛发生率低,其顺应性也相对较好。因此脱细胞生物补片有可能成为未来最有希望的盆底修复补片，但生物补片植入人体后最终会发生降解，由自身组织替代，一旦体内外原因导致自身组织替代的过程终止或障碍，则导致盆底修复手术的失败。因此，将干细胞与生物补片相结合构建新型的组织工程生物补片，提高补片生物性能，缓解补片自身降解，或促进自身组织替代及修复，将是一个新的尝试，以提高生物补片应用于盆底修复手术的远期疗效。　　本课题选择脂肪源性干细胞(adipose-drived stem cells,ADSCs)作为种子细胞，利用慢病毒转染ADSCs使其携带绿色荧光蛋白基因，将其载入脱细胞生物补片材料，构建组织工程生物补片材料，荧光示踪观察体外环境下ADSCs在脱细胞生物补片上的生长及其相容性。利用大鼠模型体内植入组织工程生物材料后，观察其生物性能及机械性能的改变，探讨ADSCs结合脱细胞生物材料构成新型的生物组织工程补片用于POP修复手术的可行性。　　第一部分：ADSCs结合P-SIS生物材料体外实验　　研究目的：　　大鼠ADSCs载入脱细胞猪小肠粘膜(Porcine small intestinal submucosa，P-SIS)生物材料构建新型的生物组织工程补片，观察体外环境下大鼠ADSCs与P-SIS生物相容性。　　材料与方法：　　1.复苏于赛业生物公司购买经鉴定的SD大鼠 ADSCs，利用携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced Green fluorescent protein,eGFP）基因的慢病毒载体转染SD大鼠的ADSCs,观察转染后ADSCs生长状况以及传代后转染的ADSCs多向分化潜能。　　2.携带有GFP基因的ADSCs种植于P-SIS表面，荧光显微镜及扫描电镜下观察ADSCs在P-SIS上贴附生长状况。　　结果：　　1、慢病毒转染SD大鼠ADSCs后的功能评价：　　1.1.慢病毒转染 SD大鼠 ADSCs的显微结构变化：慢病毒转染 SD大鼠ADSCs后荧光显微镜观察绿色荧光变化，镜下可见荧光表达稳定，传代培养后绿色荧光无衰减，细胞生长状态良好，细胞状态稳定。　　1.2.DAPI染色后可见细胞在紫光激发下细胞核呈蓝色，细胞核呈圆形，细胞均匀分散。　　1.3.慢病毒转染SD大鼠ADSCs的成脂诱导：传代培养至P5代行体外成脂诱导，12天后可见细胞胞质内见黄色小脂滴，维持诱导3-4天后可见细胞胞质内黄色脂滴逐渐增大，进行油红 O染色后可见细胞胞质内脂滴呈红色，提示慢病毒转染SD大鼠ADSCs具有向脂肪细胞分化的潜能。　　1.4.慢病毒转染SD大鼠ADSCs的成骨诱导：成骨诱导过程中，细胞生长速度稍快，细胞密集度较高，2周后可见细胞外间质矿化结节，利用茜素红染色后结节成鲜红色，提示慢病毒转染SD大鼠ADSCs具有向成骨细胞分化的潜能。　　2、慢病毒转染SD大鼠ADSCs后种植P-SIS材料生长观察：　　2.1.细胞种植于 P-SIS6小时后置于倒置荧光显微镜下观察可见细胞几乎全部贴壁生长，细胞体呈长梭形或呈不规则三角形，胞质向外伸出大小不等的突起，镜下可见绿色圆形细胞为分裂末期细胞，可见部分细胞突起为未完全贴壁细胞。　　2.2.种植24小时后观察可见细胞形态拉伸更为明显，细胞完全贴壁，相互交织联系更为紧密。　　3.转染后ADSCs接种于P-SIS材料后扫描电镜下的结构变化：　　3.1.P-SIS生物材料在扫描电镜下结构观察可见P-SIS材料表面纤维细腻，表面平整光滑，材料两面结构无显著差别，材料纵向观察可见层层均质纤维组织排列，放大后可见纤维组织平整细腻，表面光滑。　　3.2.慢病毒转染SD大鼠ADSCs细胞种植P-SIS材料表面6小时后，扫描电镜下可见细胞生长分布均匀，无聚集生长，细胞尚未全部贴壁生长，部分细胞完全贴壁，细胞呈不规则形，可见伸出大小不等突起，相互交织排列，交联呈桥样，部分细胞呈纺锤样，伸出短触角细胞尚未完全贴附于材料中生长.。　　3.3.慢病毒转染SD大鼠ADSCs细胞种植于P-SIS材料表面24小时后，扫描电镜下见慢病毒转染SD大鼠ADSCs细胞几乎完全贴附于P-SIS材料表面生长，细胞生长分布均匀，无聚集现象，细胞伸出大小不等伪足，细胞伪足较6小时观察时更为明显，伸出伪足与材料贴合密切，细胞伸出细长触角相互排列交叉，细胞联系更为密切，相互交织成桥连接状，细胞表面可见圆形分泌物附着。　　结论：　　1.携带EGFP基因的慢病毒载体转染ADSCs，细胞绿色荧光能稳定传代，对细胞生长传代不会造成影响，且不影响ADSCs细胞的成骨和成脂分化的潜能，携带EGFP基因的慢病毒载体转染细胞是一种良好的活体细胞示踪方式。　　2.P-SIS材料作为临床已经广泛应用的生物补片材料，ADSCs在P-SIS生物材料上贴附生长良好，生长状态稳定，两者体外环境下具有良好的生物相容性，为以后组织工程生物补片的构建提供实验数据。　　第二部分：大鼠体内生物组织工程材料移植模型的构建　　研究目的：　　构建大鼠体内生物组织工程材料移植模型，观察ADSCs对P-SIS植入体内后产生炎症反应，血管生成以及胶原蛋白降解的影响，探讨新型ADSCs结合P-SIS构成新型的生物组织工程补片用于盆底功能障碍性疾病手术治疗的可行性。　　材料与方法：　　1.分组：构建老龄多产雌性去势大鼠（350±50g）盆底补片植入模型。52只老龄多产的雌性SD大鼠分成：①实验组：P-SIS生物补片+ADSCs植入；②对照组：P-SIS生物补片植入，③空白对照：假手术组。对照组，实验组，空白对照组2W，4W,8W每个观察时间点取材为4只大鼠，12W实验组，对照组生物力学分析取材为8只大鼠。　　2.建模方法：老龄多产的雌性SD大鼠双侧卵巢去势后，结扎止血，将膀胱向前推开，沿双子宫交叉处向下尽量分离膀胱及下段阴道间隙，将面积约0.8×0.5cm2 P-SIS生物补片植入分离阴道膀胱间隙，两端用丝线固定于阴道两侧旁组织上，恢复膀胱正常解剖结构，可见植入补片位于膀胱及阴道前壁间隙之间，即补片植入成功，（实验组植入接种ADSCs+P-SIS生物补片；对照组植入P-SIS生物补片；空白对照组不植入任何移植物），检查无出血后关腹。12W取材的动物植入补片面积为0.8×2.4cm2，补片两端固定于阴道两侧系膜组织，补片中间部分位于分离的阴道膀胱组织。在SPF条件下饲养12周，材料植入后2W，4W,8W,时对植入补片及完全切除其贴附阴道组织部分进行取材，12W时将补片与周围组织进行分离后取材观察。　　3.标本的形态学及生物力学检测：　　3.1.大鼠处死后进行取材，用游标尺子测量补片的面积。　　3.2.2.W、4W、8W对取材补片及阴道组织沿其长轴进行纵行切片，分别进行HE染色、Masson染色，分析补片植入体内后炎症反应、新生血管、胶原含量。　　3.3.1.2W标本进行取材后对两组补片的面积大小进行统计学分析，两组标本进行生物力学分析，观察P-SIS生物材料结合ADSCs后体内的抗拉伸力及弹性形变能力。　　结果：　　1、52只大鼠直至取材处死过程中均成功，饲养过程中均未见异常表现，建模成功率达100%。　　2、HE染色分析结果　　2.1.术后第2W时标本取材HE染色后进行观察，组织切片可见实验组及对照组均可见补片及阴道组织交界处细胞浸入；高倍镜下采用对实验组，对照组以及空白对照组高倍镜视野下细胞进行计数分析。实验组91.45±32.77个/HP及对照组122.35±27.97个/HP较空白对照组62±10.20个/HP（正常组织细胞计数）P值均＜0.05，差异均具有统计学意义，实验组及对照组比较P＜0.05差异具有统计学意义。　　2.2.术后4W时标本HE染色高倍镜下毛细血管计数实验组7.05±2.50个/HP较对照组3.00±1.69个/HP，P＜0.05差异具有统计学意义。　　2.3.术后8W时标本HE染色高倍镜下毛细血管计数实验组3.09±1.35个/HP较对照组2.56.00±1.47个/HP，P=0.745＞0.05,差异不具有统计学意义。　　3、MASSON染色分析结果　　3.1.术后第4W两组 MASSON染色半定量分析两组胶原蛋白含量百分比,实验组0.6435±0.0609较对照组0.6262±0.0919，P=0.627＞0.05差异不具有统计学意义。　　3.2.术后第8W两组MASSON染色半定量分析两组胶原蛋白含量百分比，实验组0.553827±0.1521较对照组0.3892±0.0754，P＜0.05差异具有统计学意义。　　3.3.第4W和第8W胶原蛋白含量百分比进行比较,实验组4W和第8W胶原蛋白含量百分比进行比较0.6435±0.0609较0.553827±0.1521, P=0.218＞0.05,差异不具有统计学意义；对照组第4W和第8W胶原蛋白含量百分比进行比较，0.6262±0.0919较0.3892±0.0754，P＜0.05差异具有统计学意义。　　4、12W后补片取材后观察实验组与对照组取材后两组材料面积进行统计学分析，实验组79.65±33.36 mm2较对照组69.48±19.35mm2，P=0.471＞0.05差异不具有统计学意义。两组进行生物力学分析，对两组材料可耐受的最大拉伸力F以及材料弹性模量（N/mm2）进行统计学分析结果差异不具有统计学意义。　　结论：　　1.ADSCs与P-SIS结合后构建的组织工程生物补片在体内产生炎症反应小；可早期促进周围组织新生血管生成，促进组织生长修复。　　2.ADSCs与 P-SIS结合的早期具有缓解材料胶原蛋白降解作用；ADSCs对P-SIS的生物力学性能的作用需进一步大样本实验观察。