研究背景：近年的研究表明肺癌已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%。一直以来,对肺癌的早期诊断及治疗缺乏有效的手段,手术切除、化疗和放疗是非小细胞肺癌患者治疗的主要方式。然而,患者术后的生存情况并不理想,5年的生存率不足20%,肿瘤转移及复发决定着患者术后的生存。因此,研究与肺癌发生、发展及转移相关的分子标志物,探讨其作用机制对肺癌的早期诊断、治疗及预后评估具有极其重要的意义。PBK/TOPK(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase)是一种新颖的蛋白激酶,最早于淋巴因子激活的杀伤性T细胞(T-LAK)中发现,具有322个氨基酸,与恶性肿瘤的增殖调控密切相关,在恶性肿瘤中呈高表达,除正常睾丸组织和一些胚胎组织外,其它正常组织中均难以检测到其表达。Ki-67是一种较为常见的细胞增殖标记物,现广泛应用于临床病理诊断中。p53基因是一种抑癌基因,分为野生型及突变型两种亚型,其中野生型p53可调节DNA的修复及细胞的凋亡,突变型p53与肿瘤的形成密切相关。关于PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的作用机制是否与Ki-67及p53有关,未见相关报道,为此我们进行了研究。研究目的及内容：1.探讨PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的表达及其预后意义；2.探讨PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中表达的相关性及其预后意义；3.探讨PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响；4.探讨PBK/TOPK在非小细胞肺癌细胞中的表达与Ki-67及p53的关系；材料及方法：1. PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达及其预后意义分析免疫组化SP法检测30例正常成人肺组织、30例肺良性病变、279例非小细胞肺癌原发灶及32例淋巴结转移灶中PBK/TOPK蛋白的表达；用计算机ImageproPlus6.0(IPP)图像分析软件定量测试蛋白表达的阳性单位(PU值),结合临床相关病理资料及随访资料进行统计学分析及术后生存分析。2. PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中表达的相关性及其预后意义分析免疫组化SP法检测279例非小细胞肺癌组织中PBK/TOPK、Ki-67及p53蛋白的表达,采用半定量方法对免疫组化结果进行分析,探讨PBK/TOPK蛋白与Ki-67及p53蛋白表达的相关性,结合临床相关病理资料及随访资料进行术后生存分析。半定量分析方法及参考标准：阴性：无色或淡黄色；阳性：棕黄色或棕褐色；分别统计PBK/TOPK、Ki-67及p53在非小细胞肺癌组织中阳性表达细胞的百分比,取其平均值作为半定量判定的临界值。3. PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响实验分为干扰组和对照组,选用PBK/TOPK高表达的A549和GLC-82两株腺癌细胞同时进行。干扰组采用siRNA干扰片段对两株细胞中PBK/TOPK的表达进行干扰,使PBK/TOPK表达明显下调,对照组未进行任何处理。通过划痕实验和Transwell实验检测PBK/TOPK下调后细胞的迁移能力,同时采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及台盼蓝染色法检测PBK/TOPK下调后细胞的增殖及存活能力。4. PBK/TOPK在非小细胞肺癌细胞中的表达与Ki-67及p53的关系采用四株肺癌细胞,其中包括3株肺腺癌细胞(A549、GLC-82和H358)及1株大细胞肺癌细胞(H460),通过荧光定量PCR(QRT-PCR)、免疫印迹(Western blot)及细胞滴片免疫组化法检测四种细胞株中PBK/TOPK和p53的表达。同时采用细胞滴片免疫组化法检测Ki-67蛋白的表达,采用IPP图像分析软件定量检测蛋白表达的阳性单位(PU值)。对PBK/TOPK表达较高的两株细胞株进行siRNA干扰,采用QRT-PCR和Western blot验证其干扰效率,再分别检测Ki-67及p53的表达,探讨PBK/TOPK下调是否会影响Ki-67及p53的表达。5.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。两样本均数间的比较采用独立样本t检验。多样本均数间的比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间多重比较采用LSD,若方差不齐,组间的多重比较采用Dunnett’s T3检验。采用Spearman秩相关进行相关分析。术后总体生存率的比较采用Pearsonx2检验,利用Kaplan-Meier法log rank检验进行单因素生存分析,多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型。结果：1. PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达及其预后意义分析免疫组化定量分析表明PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达差异具有非常的显著性(P=0.000),其中淋巴结转移灶中PBK/TOPK表达的PU值高于原发灶、肺良性病变及正常肺组织。PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的表达与组织学类型、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关(P值分别为0.027、0.000、0.000、0.000),而与其它临床病理特征无明显相关(P>0.05)。免疫组化半定量分析结果显示PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变及非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的高表达率分别为：0%、0%、44.8%、75%,组内比较差异具有非常的显著性(P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析结果表明PBK/TOPK蛋白的表达、淋巴结转移、TNM分期及远处转移与非小细胞肺癌患者的预后有关(P值均为0.000)。Cox比例风险回归模型分析表明PBK/TOPK的表达、淋巴结转移及TNM分期是影响非小细胞肺癌患者预后评价的因素(P值分别为0.000、0.009、0.022)。2. PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中表达的相关性及其预后意义分析在279例非小细胞肺癌原发灶组织中PBK/TOPK、Ki-67与p53的高表达率分别为44.8%、64.9%、49.1%。PBK/TOPK与Ki-67及p53的表达均具有正相关性(r=0.249,P=0.000；r=0.153,P=0.000)。在本研究中PBK/TOPK、Ki-67及p53蛋白高表达患者的5年生存率分别为：12.4%、18.2%、21.2%。单因素生存分析结果表明PBK/TOPK蛋白、Ki-67蛋白及p53蛋白的表达均与非小细胞肺癌患者的预后有关(P值分别为0.000、0.000、0.003)。PBK低/Ki-67低患者的术后中位生存期明显高于PBK低/Ki-67高及PBK高/Ki-67高患者(P=0.029；P=0.000)；PBK低/p53低患者的术后中位生存期明显高于PBK高/p53低及PBK高/p53高患者(P=0.001；P=0.000)。Cox比例风险回归模型的多因素分析表明PBK/TOPK、Ki-67及p53的表达均可作为影响非小细胞肺癌患者预后评估的因素(P值分别为0.000、0.015、0.034)。3. PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响经siRNA干扰后,GLC-82及A549细胞中的PBK/TOPKmRNA表达水平下调分别约83.6%、69.9%。划痕实验及Transwell实验结果表明PBK/TOPK下调可明显抑制细胞的迁移。其中,在A549与GLC-82细胞的划痕实验中,干扰组细胞的迁移距离显著低于对照组(P值分别为0.006、0.000)。在A549与GLC-82细胞的Transwell实验中,干扰组的细胞迁移数量也明显低于对照组(P值均为0.000)。MTT实验结果表明PBK/TOPK下调可抑制细胞的增殖。在A549与GLC-82细胞中,干扰组细胞的增殖能力明显低于对照组,干扰48小时后差异较为明显(P值均为0.000)。台盼蓝染色结果表明PBK/TOPK下调可降低细胞的存活能力。在A549与GLC-82细胞中,干扰组与对照组相比,PBK/TOPK下调后细胞的存活率均明显降低(P值分别为0.002、0.005)。4. PBK/TOPK在非小细胞肺癌细胞中的表达与Ki-67及p53的关系经QRT-PCR检测发现PBK/TOPK mRNA在A549、GLC-82、H358及H460四株肺癌细胞中均有表达,其中在H358及GLC-82细胞中表达较高,在A549及H460细胞中表达较低。Western blot及细胞滴片免疫组化检测结果均表明PBK/TOPK蛋白在H358及GLC-82细胞中表达较高,在A549及H460细胞中表达较低。PBK/TOPK蛋白在四种细胞中表达的PU值比较,差异具有显著性(P=0.000)。经QRT-PCR检测发现突变型p53mRNA在A549、GLC-82、H358及H460四种肺癌细胞中均有表达,其中在H358、H460及A549细胞中表达较高,在GLC-82细胞中表达较低；Western blot及细胞免疫组化检测结果表明p53蛋白在H358、H460及A549细胞中表达较高,在GLC-82细胞中表达较低。p53蛋白在四种细胞中表达的PU值比较,差异具有非常的显著性(P=0.000)。细胞滴片免疫组化检测Ki-67蛋白在四种肺癌细胞中的表达,结果表明Ki-67在四种细胞中均呈高表达,PU值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。将高表达PBK/TOPK的A549及GLC-82细胞分别经siRNA干扰,PBK/TOPK表达明显下调,A549和GLC-82细胞中PBK/TOPK mRNA下调分别为69.9%、83.6%,检测突变型p53mRNA的表达,发现PBK/TOPK下调可促使其下调,其中在A549和GLC-82细胞中p53mRNA表达下调分别为74.5%、68.5%,p53蛋白表达水平也下调。细胞滴片免疫组化检测表明PBK/TOPK下调后A549和GLC-82细胞中Ki-67蛋白表达水平也出现了明显下调,与对照组相比,PU值明显减小(P值均为0.000)。结论：1. PBK/TOPK的表达与非小细胞肺癌的形成及转移有关；PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的表达与组织学类型、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关,其表达可作为影响非小细胞肺癌患者预后评估的要素。2. PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中的表达均呈正相关性,PBK高/Ki-67高及PBK高/p53高的患者预后较差。3.Ki-67及p53的高表达与非小细胞肺癌患者预后不良相关,均可作为影响非小细胞肺癌患者预后评估的要素。4. PBK/TOPK具有促进非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活的能力。5. PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的作用机制与Ki-67及p53密切相关。PBK/TOPK的表达可调控p53, PBK/TOPK表达下调可使突变型p53mRNA及蛋白表达下调。此外,PBK/TOPK表达下调可抑制Ki-67蛋白的表达。