冠心病具有高发病率和高死亡率,严重威胁人类的生命健康,近年来,由于生活节奏加快,社会竞争日趋激烈,冠心病合并抑郁、焦虑、失眠等情况屡见不鲜,这些精神心理障碍影响着冠心病的发生发展和预后,“双心”疾病逐渐受到重视。现阶段,西医将心血管药和抗抑郁药、镇静催眠药等连用,暂时解决了部分精神心理症状,然而其副作用多、远期疗效差、耐药性和成瘾性等问题未得到有效的解决,且全身症状也未能有效改善。因此,寻找安全有效的补充与替代医学改善全身症状及防治“双心”异常是当前冠心病领域要重点解决的问题。目前中医药在冠心病的防治中有着特殊地位。中医中药治疗冠心病“双心”异常有良好的临床疗效,目前虽有大量中医药对冠心病影响的研究,而针对单靶点研究的药物应用于临床疗效不佳,究其原因是缺乏接近于临床的多因素复合模型的研究,而现阶段尚未出现冠心病“双心”异常的动物模型及药物干预研究。因此建立冠心病“双心”异常的动物模型有助于进一步的药物研究。在已有的基础研究中,睡眠剥夺(sleep deprivation, SD)可引起焦虑、烦躁、抑郁等精神心理障碍,心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)又是冠心病溶栓、支架术和冠脉搭桥术后涉及的重要的病理生理过程,建立睡眠剥夺心肌缺血再灌注模型,以模拟冠心病“双心”异常的表现,观察机体病理改变,在此基础上观察药物的心血管保护作用及其机制,从而为冠心病的药物研发提供基础支持。中医认为心主血脉、心主神志,冠心病发生时心之气血阴阳受损,痰浊瘀血堆积,心主血脉和心主神志功能异常,可出现“双心”异常。活血安神法为冠心病“双心”异常的重要治法,基于活血安神法形成的活血安神方由丹参、三七、酸枣仁等药物组成,活血祛瘀、调心安神对胸闷心痛,烦躁失眠等症状有良好改善。前期研究发现,该方能有效缓解临床症状,改善心肌损伤相关指标,但尚未对冠心病合并焦虑抑郁失眠等的作用进行基础研究。因此,更进一步明确活血安神方对冠心病“双心”异常的影响有重要意义。本实验旨在探讨活血安神法“双心”同调对睡眠剥夺心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制,为活血安神法则治疗冠心病“双心”异常提供实验依据,并为开发防治冠心病“双心”异常的新药提供可参依据。1.目的观察不同睡眠剥夺时间对机体病理变化的影响,确定使机体发生病理变化最明显的时间后,建立睡眠剥夺合并心肌缺血再灌注模型以模拟临床冠心病“双心”异常,通过观察神经内分泌变化,血管内皮功能,炎症反应和心肌损伤程度判定复合模型建立成功。在此基础上探讨活血安神方对睡眠剥夺应激心肌缺血再灌注损伤的影响,从心功能、心肌酶、心梗面积、心肌组织形态和心肌细胞凋亡等多方面观察其心血管保护作用及机制,以探讨冠心病“双心”异常的基础病理变化及活血安神方的多途径、多环节保护作用,为活血安神法治疗冠心病“双心”异常提供部分实验依据。2.方法将大鼠随机分为对照组和睡眠剥夺组(SD组),睡眠剥夺造模采用“改良多平台水环境法”,观察两组大鼠SD前、SD2天、SD5天、SD7天的体重和矫正QT间期,分别眼球取血测血清褪黑素(MT)、内皮素(ET-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,确定SD后各病理变化最明显的7天为进一步研究的时间。随后将大鼠随机分组：假手术组、普通模型组、SD模型组、活血安神方组,SD7天并预防性给药7天。第7天一部分大鼠留取血清、血浆和心脏,剩余大鼠麻醉后结扎冠脉左前降支50min分别再灌2h、24h建立心肌I/R模型。观察SD前后大鼠的一般状态和体重,SD后检测血浆儿茶酚胺(CA)和神经肽Y (NPY),血清血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、C反应蛋白(CRP)、一氧化氮(NO)、ET-1、MT、IL-6、TNF-α,心肌组织TNF-α; I/R后2h检测同样指标及肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH),心脏做HE染色观察心肌病理组织改变,TUNEL检测心肌细胞凋亡情况,免疫组织化学法分析心肌NF-κB、Bcl2、Bax和Caspase 3阳性表达情况,Western blot检测心肌组织NF-κBp65、 Bcl2、Bax和Caspase 3的蛋白表达量；I/R后24h进行TTC-伊文思蓝染色并计算梗死面积和梗死占缺血面积的百分比；I/R前、I/R后2h、24h均进行超声检测,记录心脏射血分数(EF)和心率(HR)。3.结果3.1睡眠剥夺天数确定：随SD时间延长,QTc间期逐渐延长,MT水平逐渐降低,ET-1、 IL-6、TNF-α水平逐渐升高,与对照组比,SD组7天时各指标的差异均有统计学意义(P<0.05),因此选SD7天作为后期实验基础。3.2活血安神方对神经内分泌的影响：SD7天后大鼠精神状态差,狂躁易激惹,体重明显减轻,血清MT降低,血浆CA、NPY,血清AngⅡ、ET-1、NO、IL-6、TNF-α,心肌TNF-α均升高,与普通模型组比差异均有统计学意义(P<0.05),而活血安神方可降低SD后NPY、AngⅡ、ET-1、IL6和TNF-α的水平,抑制MT的降低,与SD模型组比差异均有统计学意义(P<0.05)；叠加I/R后,SD模型组AngⅡ、ET-1、IL-6、TNF-α和CRP的浓度均比普通模型组高,活血安神方可降低SD+I/R后各指标的水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.3睡眠剥夺心肌缺血再灌注模型建立：与假手术组和与普通模型组(I/R)比,SD模型组(SD+I/R)血清AngⅡ、CRP、ET-1、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH均升高,心肌TNF-α水平升高,I/R后2h和24h的EF均明显降低,心肌梗死面积和梗死占缺血面积的百分比明显增大,心肌组织病理损伤加重,心肌细胞凋亡指数明显增加,NF-κB和Caspase 3蛋白表达水平增加,Bc2/Bax的比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05),说明SD+I/R比单纯I/R的心肌损伤严重,证明睡眠剥夺心肌缺血再灌注模型即SD模型建立成功。3.4活血安神方对心功能和心肌酶的影响：与SD模型组比,活血安神方可明显改善I/R后2h和I/R后24h的EF,降低I/R后2h血清心肌酶CK-MB和LDH,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.5活血安神方对心梗面积的影响：与SD模型组比,活血安神方可显著地减少I/R后24h的心肌梗死面积,降低心肌梗死占缺血面积的百分比,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.6活血安神方对心肌组织病理的影响：活血安神方组大鼠心肌组织损伤程度比SD模型组轻,心肌细胞排列略规则,炎性细胞较少浸润。3.7活血安神方对心肌细胞凋亡及相关通路的影响：与SD模型组比,活血安神方可减少细胞凋亡指数,降低NF-κB和Caspase 3表达,升高Bcl2/Bax比值,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.结论(1)不同SD天数对心血管病致病因子的影响有差异,SD7天时机体各种病理变化最明显,显著增加心血管病风险。(2)SD后大鼠体重明显减轻,精神状态差,神经内分泌失调,进一步引发内皮功能障碍和炎症反应,增加心血管病相关危险病理因素；活血安神方可改善SD诱导的神经内分泌紊乱,进而减轻血管内皮功能障碍和炎症反应,减少心血管病相关致病因子。(3)SD+I/R后心功能EF值下降,心肌酶升高,心肌组织病理损伤严重,心梗面积增大,心肌细胞凋亡加重,比单纯I/R损伤严重,说明SD能使I/R损伤加重,证明睡眠剥夺心肌缺血再灌注模型成功,可初步阐明冠心病“双心”异常的基础病理变化,并为中药治疗提供基础支持。(4)活血安神方不仅可改善SD引起的神经内分泌失调,减少心血管病危险病理因素,降低心血管风险,还可改善SD+I/R后的心功能,减小梗死面积,减轻病理组织损伤和细胞凋亡,这可能是通过抑制SD后NPY的释放,降低TNF-α等炎症因子的水平,进而调节炎症凋亡相关NF-κB通路,减少NF-κB活化及Caspase-3表达,升高Bcl2/Bax的比值,多途径、多环节对心肌损伤发挥保护作用。