研究背景：肺癌是当前全世界发生率及死亡率最高的恶性肿瘤,它起病隐匿、发展迅速、早期发现与诊断困难,治疗效果和预后很差。2010年美国有222520例新发肺癌病例,占所有新发肿瘤的15%；死亡157300例,占所有肿瘤的28%,均位居第一。根据病理学分型,NSCLC约占确诊肺癌总数的80-85%,其余为小细胞肺癌。在新确诊的NSCLC中,仅有16%的病例属于早期,大多数NSCLC患者确诊时已为晚期,非手术治疗方法是针对这部分患者的主要措施。研究表明,广泛表达于NSCLC细胞表面的一种酪氨酸激酶跨膜蛋白：表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)与调控肿瘤扩增、生存、转移及血管生成的信号通路密切相关。基于此,以吉非替尼(Gefitinib)为代表的一批小分子EGFR-TKI靶向药物应运而生,成为晚期NSCLC患者的首选治疗药物。对于某些EGFR基因突变的患者,与传统化疗相比,应用Gefitinib可获得更好的生存获益。尤其在亚裔中,NSCLC患者中EGFR的敏感突变率可达到30%。看起来Gefitinib将为众多肺癌患者带来极大的希望,但随着用药时间的持续,科学家们发现,目前临床上应用的所有小分子EGFR-TKI在治疗一段时期后,患者最终结果仍然是耐药复发,一旦出现获得性耐药突变,患者将失去最后的希望。解决EGFR-TKI耐药问题一般有两种思路：开发新的靶向治疗药或者寻求不同药物的联用方案。而后者实施起来更为高效、快捷。一些黄酮、多酚类低毒或无毒的植物提取物的抗肿瘤效应引起了科学家的重视。因此,将常规抗癌药物与植物类化合物有效地相结合,能降低药物给药剂量,一方面减少抗癌药物对机体产生的毒副作用,另一方面也提高了抗癌药物的生物学活性,这对提高患者的生存质量尤为迫切和需要。4,5,7-三羟基异黄酮(Genistein)是一种天然的酪氨酸蛋白激酶抑制剂,其抗癌作用近年来倍受关注。Genistein可作用于EGFR介导的细胞信号传导通路的多个节点蛋白,在不同水平发挥酪氨酸激酶抑制作用。其多靶点的TKI活性为设计新的靶向治疗联用方案,打开了一扇大门。一定剂量的Genistein既能诱导肿瘤细胞分化又具有凋亡的作用,但单独使用Genistein对肿瘤细胞的诱导分化和促凋亡作用均较弱。因此,研究如何既能减低抗肿瘤药物剂量、减轻其毒副作用,又能增强或不减弱药物的抗肿瘤效果就显得尤为重要。有学者就认为探索低剂量多药联合应用,是肿瘤药物治疗研究的一个十分重要的方向。研究目的：本课题拟通过比较Gefitinib或Genistein单药与两者联合使用对H1975人肺癌细胞株增殖、凋亡及相关蛋白PARP和caspase-3表达的影响,以及EGFR、Akt、Erk1/2和mTOR信号传导通路中的关键蛋白的磷酸化水平,从分子水平验证联合用药较之单独用药是否存在增强药物抗肿瘤效果。在此基础上通过裸鼠成瘤实验从体内、体外水平共同探索EGFR信号传导通路与药物抗肿瘤活性关联的分子机制。研究结果将有助于为“膳食植物素结合靶向治疗或化学预防来抑制获得性耐药突变非小细胞肺癌”提供新的理论依据。材料与方法：整个实验分为两部分。第一章：染料木黄酮联合吉非替尼抑制获得性耐药突变非小细胞肺癌分子机制的研究本研究拟选择EGFR突变型肺癌细胞株,研究比较吉非替尼或／和染料木黄酮三种不同用药方式的细胞毒作用及其机制,为“膳食植物素结合靶向治疗或化学预防来抑制获得性耐药突变非小细胞肺癌”提供理论依据。选择EGFR耐药突变肺癌细胞株H1975,H1975细胞含有EGFR20外显子T790M突变和21外显子L858R突变,对EGFR-TKI耐药。通过单独使用不同剂量Gefitinib或Genistein及两者联合处理H1975人肺癌细胞株,动态观察H1975细胞生长情况,采用MTT法检测各组细胞增殖抑制情况；采用Chou-Talalay方程计算CI值(协同指数)；流式细胞仪进行凋亡率检测；Western blotting法检测凋亡相关基因PARP和caspase-3蛋白表达情况及EGFR、Erk、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平,分析Gefitinib联合Genistein能否协同增强抗肿瘤效应。第二章：染料木黄酮联合吉非替尼对获得性耐药突变非小细胞肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制使用BALB/c遗传背景的雌性裸鼠作为实验动物,6-8周龄,SPF级饲养。人肺腺癌细胞株H1975用含有15%小牛血清RPMI 1640在37℃、5%CO2条件下培养。于每只裸鼠背部皮下注射4×106个细胞,建立获得性耐药非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。移植瘤体积达到-100mm3时,采用随机数字法将40只裸鼠随机分成4组,每组10只进行实验：(1)5%吐温80溶液对照组；(2)150mg/kg Genistein组；(3) 50 mg/kg Gefitinib组；(4) Genistein 150 mg/kg+Gefitinib50 mg/kg两药联用组。5周末,将所有存活裸鼠麻醉后处死,摘除裸鼠移植瘤,测量肿瘤体积,计算协同指数q值和抑瘤率,10%中性甲醛溶液固定瘤体。用免疫组化SP法进行原位细胞增殖分析,计算增殖指数；用TUNEL法进行原位细胞凋亡分析,计算细胞凋亡指数。结果：第一章：染料木黄酮联合吉非替尼抑制获得性耐药突变非小细胞肺癌分子机制的研究1. Gefitinib联合Geni stein对H1975细胞的生长抑制作用在分别给予H1975细胞Genistein单药48h, Gefitinib单药48h,以及Genistein与Gefitinib同时处理细胞48h后,我们观察到Genistein、Gefitinib单药以及Genistein+Gefitinib联合用药产生了不同的抗增殖效果。各处理组随药物浓度增加,抑制效应逐渐增强,其中Genistein+Gefitinib联合用药组抑制效应最为明显。两者联合用药对H1975细胞的增殖抑制作用强于Genistein、Gefitinib单药组,协同增效作用明显,镜下观察细胞数明显减少。One-way ANOVA检验分析结果显示,Genistein+Gefitinib两药联用对细胞的抗增殖效应优于Gefitinib单药组,抑制率升高,并呈现剂量依赖的抗增殖效应,差异显著,具有统计学意义(P=0.000, P=0.001,.P=0.000, P=0.001,P=0.013, P=0.017)。由此提示Gefitinib联合Genistein具有协同抑制H1975细胞增殖的作用。采用CalcuSyn软件计算联合用药的CI值,发现随着药物浓度的增高(G1-G6),抑制效果逐渐增强,CI值均小于1(CI<1,CI=1,CI>1分别代表协同、附加和拮抗效应),说明二者结合对细胞的抑制具有协同效应。其中G1、G2、G3三个剂量组,表现出强烈的协同效应(CI<0.7)。2. Gefitinib联合Genistein对H1975细胞凋亡的影响MTT抗增殖实验证明联合用药相比单药治疗,可协同抑制H1975细胞生长,认为该现象可能与细胞的凋亡及其机制相关,因此我们应用流式细胞仪检测Genistein和Gefitinib单药、联合用药对肿瘤细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测结果提示：单用Geifitinib或Genistein处理H1975细胞48h均可促使其凋亡,细胞凋亡率分别为(42.03±4.38)%和(35.95±2.32)%。但经联合处理后,H1975细胞凋亡增加,为(68.70±7.13)%(Combination vs. Gefitinib,P=0.000),具有显著性差异,提示Geifitinib联合Genistein具有协同促进H1975细胞凋亡的作用。3. Gefitinib联合Genistein对H1975细胞凋亡相关蛋白表达的影响本研究证实,Gefitinib. Genistein单药均不能有效激活与凋亡相关的分子,PARP和caspase-3的表达均降低。而两药联用之后,其PARP和caspase-3的断裂片段水平增加,提示PARP和caspase-3在Gefitinib或/和Genistein诱导的H1975细胞凋亡过程中起重要作用,PARP和caspase-3可能是两个主要的调控基因。4. Gefitinib联合Genistein对EGFR及其下游信号通路EGFR的影响为了揭示Gefitinib以及Genistein的联用作用机制,我们研究这两种药物对细胞EGFR及其下游信号通路的作用。Gefitinib或/和Genistein孵育H1975细胞12h后,Western blotting检测相关蛋白的表达。与Gefitinib单药组相比,两药联用组EGFR. AKT和mTOR磷酸化水平均明显降低,差异显著,具有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；而对Erk1/2磷酸化水平却没有抑制作用,差异无显著性意义(P=0.174)。第二章：染料木黄酮联合吉非替尼对获得性耐药突变非小细胞肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制1. Gefitinib联合Genistein对非小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的影响：实验结束后,测量各组裸鼠肿瘤体积,Genistein. Gefitinib和Combination组平均瘤体积均明显低于对照组。Control. Genistein. Gefitinib和Combination组的肿瘤体积分别为(2138.59±279.00)mm3、(1689.48±220.41)mm3、(1475.63±192.51)mm3和(405.28±65.57)mm3,其中Combination组肿瘤体积与Gefitinib组减少,具有显著性差异(P=0.000)；抑瘤率分别为0.00%,21.00%,31.00%和81.05%,其中Combination组抑瘤率最高。根据抑瘤率公式计算：Genistein与Gefitinib两药合用q值为1.78,说明两药联用对抑制肿瘤的生长具有协同作用,与第一部分的细胞实验结果相一致。2. Gefitinib联合Genistein对非小细胞肺癌裸鼠移植瘤细胞增殖的抑制作用：经Ki67染色后细胞核着棕黄色,Genistein.Gefitinib和Combination三组较Control组相比,棕黄色增殖细胞明显减少,细胞增殖率依次为Control(29.37±7.47)%.Genistein(21.64±6.30)%.Gefitinib(11.88±3.45)%.Combination(7.48±1.91)%,呈下降趋势。其中Combination组细胞增殖率较Gefitinib组显著降低(P=0.000),说明两药联用较Gefitinib单独使用,对肿瘤细胞的增殖具有协同抑制效应。3. Gefitinib联合Genistein对非小细胞肺癌裸鼠移植瘤细胞凋亡的诱导作用：肿瘤组织经TUNEL染色后细胞核呈均匀的绿色荧光,Genistein.Gefitinib和Combination三组较Control组相比,凋亡的绿色细胞明显增多,细胞凋亡率依次为Control(9.31±1.63)%.Genistein(15.76±3.08)%.Gefitinib(32.63±6.24) %.Combination(54.71±9.61)%,呈逐渐上升趋势。其中Combination组细胞凋亡率较Gefitinib组显著升高,具有显著性差异(P=0.000),说明两药联用较Gefitinib单独使用,对肿瘤细胞的凋亡具有更好的协同诱导效应。结论：1.Gefitinib联合Genistein对H1975人肺癌细胞的增殖具有协同抑制作用。CalcuSyn软件计算联合用药的CI值,CI<0.7,表现出强烈的协同效应。2.Gefitinib联合Genistein对H1975人肺癌细胞凋亡具有协同促进作用,可能与两者协同调节凋亡相关蛋白PARP和caspase-3的表达有关。3.Gefitinib联合Genistein对H1975人肺癌细胞EGFR.Akt和mTOR磷酸化水平具有明显的协同抑制作用,因而可能对肺癌细胞的侵袭、转移潜能有抑制作用。4.Gefitinib或Genistein可不同程度地抑制获得性耐药非小细胞肺癌移植瘤生长,两者联合应用对肿瘤生长的抑制效果更加明显,q值为1.78。5. Gefitinib联合Genistein对获得性耐药非小细胞肺癌移植瘤的增殖具有协同抑制作用。6. Gefitinib联合Genistein对获得性耐药非小细胞肺癌移植瘤的凋亡具有协同促进作用。