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目的： 肺癌高居全球恶性肿瘤发病率和死亡率的首位，其中肺腺癌仍是主要的病理类型。对于进展期的肺腺癌患者，化疗依然是目前最重要的治疗方式。随着大批化疗新药的广泛应用，化疗的有效率已较过去有所提高，但仍然有半数以上的患者并未能从化疗中获益。化疗耐药的产生仍是限制晚期肺腺癌患者临床疗效的重要障碍。因此，深入阐明肺腺癌化疗耐药的机制并寻找有效分子靶标指导精准化疗已成为提高肺腺癌疗效的重要研究方向。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，参与细胞的多种生理及病理过程。自噬的发生与肿瘤耐药之间亦存在密切联系。本研究旨在前期成功建立肺腺癌多西他赛耐药细胞模型的基础上，通过电镜、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因等实验方法，阐明自噬在肺腺癌化疗耐药形成中的作用，并从翻译后及转录后水平分别探索HMGB1/MEK/ERK1/2/Beclin-1-PI3KⅢ及miR-200b/ATG12信号通路调控自噬参与肺腺癌化疗耐药形成的分子机制，从而为肺腺癌的个体化治疗和逆转肺腺癌耐药提供新的临床策略。 材料与方法： 1.人肺腺癌化疗耐药细胞系SPC-A1/DTX和H1299/DTX为本实验室前期自建，其表现出对多西他赛、紫杉醇、顺铂、卡铂、吉西他滨、长春瑞滨等多种化疗药物的耐药特性。分别运用电镜、Western Blot、GFP-LC3单荧光体系检测人肺腺癌细胞株SPC-A1、H1299及其相应耐药细胞株SPC-A1/DTX、H1299/DTX的自噬水平;浓度依赖性实验中多西他赛以不同浓度(0，5，10，20μg/L)处理亲本细胞24h，时间依赖性诱导实验中多西他赛以10μg/L浓度处理亲本细胞不同时间(0，6，12，24h)，Western Blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62表达改变。 2.采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）或合成针对自噬基因ATG5的siRNA抑制亲本及耐药细胞自噬后，Western Blot验证LC3-Ⅱ/Ⅰ表达改变;MTT法检测细胞化疗敏感性改变;克隆形成实验检测细胞增殖能力改变;流式细胞术检测细胞凋亡率改变。 3.Western Blot检测亲本及耐药细胞中总高迁移率族蛋白1(High-mobility group box1，HMGB1)、胞核型-HMGB1（nuclear-HMGB1）和胞质型-HMGB1（cytosolic-HMGB1）表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中HMGB1表达;时间依赖性诱导实验中多西他赛以10μg/L浓度处理亲本细胞不同时间(0，3，6，12，24，48h)，Western Blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、HMGB1、nuclear-HMGB1、cytosolic-HMGB1表达改变;ELISA法检测上清液中HMGB1表达变化。 4.明确HMGB1是否存在对自噬的调控。体外功能学实验中采用HMGB1胞质转位抑制剂丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)或下调耐药细胞HMGB1表达（HMGB1shRNA），或者将pcDNA3.1HMGB1或相应空转质粒转染亲本细胞后，再给予3-MA处理，Western Blot及GFP-LC3单荧光体系验证自噬水平变化，MTT、克隆形成实验和流式细胞术分别检测细胞化疗敏感性、细胞增殖能力和细胞凋亡率改变。 5.体内实验中通过筛选HMGB1shRNA及其对照质粒稳定转染的SPC-A1/DTX细胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤后给予1mg/Kg多西他赛腹腔内注射（以生理盐水为对照），5周后处死裸鼠。绘制肿瘤生长曲线，Western blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和HMGB1表达，H&E染色观察肿瘤结构，免疫组化染色检测增殖相关标志物PCNA和HMGB1表达，TUNEL染色检测各组凋亡水平差异。 6.Western Blot检测HMGB1表达改变对Akt/mTOR及MEK/ERK1/2/Beclin-1-PI3KⅢcomplex信号通路活性的影响。免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation assay,IP)检测HMGB1表达改变对Beclin1与PI3KⅢ结合能力的影响。 7.结合前期SPC-1/DTX与SPC-A1细胞的miRNA差异表达谱，合成耐药细胞中各高表达miRNA的单链抑制物(AmiR-192，AmiR-424，AmiR-98)以及各低表达miRNA的类似物（PmiR-200b，PmiR-194，PmiR-212）分别转染SPC-A1/DTX细胞，荧光实时定量PCR(Real-time PCR)验证转染后备miRNA表达水平，Western blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ表达，结果提示miR-200b为耐药细胞中自噬调控的miRNA。 8.将PmiR-200b或miR-200b抑制物(AmiR-200b)及相应的NC分别转染耐药细胞或亲本细胞，Western Blot和GFP-LC3单荧光体系检测自噬水平变化。 9.应用三种不同的miRNA靶基因数据库(http://www.microrna.org/microma/home.do;http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/:http://www.targetscan.org/)对miR-200b下游靶基因进行生物信息学预测，并通过双荧光素酶报告基因验证，结果证实自噬基因ATG12为miR-200b下游靶基因。 结果： 1.SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞自噬水平均明显高于相应亲本细胞，并且随着多西他赛作用浓度升高和时间延长，亲本细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ表达呈进行性升高，P62表达呈进行性降低。 2.采用自噬抑制剂3-MA或ATG5siRNA抑制亲本及耐药细胞自噬可显著增加细胞对多西他赛的化疗敏感性，降低细胞增殖能力，促进细胞凋亡。 3.SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞较其亲本细胞而言，cytosolic-HMGB1呈高表达，nuclear-HMGB1呈低表达，上清液中HMGB1表达无明显差异;随着多西他赛处理亲本细胞时间延长，nuclear--HMGB1表达逐渐降低，cytosolic-HMGB1表达和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达均逐渐升高。 4.体外实验中采用EP或下调SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞HMGB1表达可抑制细胞自噬，提高对多西他赛敏感性，降低细胞增殖能力，促进凋亡;相反，上调SPC-A1和H1299中HMGB1表达可促进自噬发生，增加对多西他赛的化疗抵抗，但同时给予3-MA或EP处理后则可逆转上述现象。 5.体内实验中，给予多西他赛处理后，HMGB1shRNA组较对照组而言，皮下移植瘤生长明显减慢，移植瘤组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ表达及PCNA阳性率显著降低，细胞凋亡水平明显增高。 6.在分析HMGB1对自噬经典信号通路AKT/mTOR和MEK/ERK1/2活性的影响时，发现改变HMGB1表达并不能影响Akt和mTOR的磷酸化;而上调SPC-A1细胞HMGB1表达可促进ERK1/2磷酸化，并通过MEK/ERK1/2途径依次促进Beclin-1-PI3KⅢ复合体形成，抑制MEK通路活化可明显减弱该现象发生。相反地，上调MEK通路活性也可部分逆转HMGB1低表达对该复合物形成的抑制作用。 7.前期miRNA芯片显示耐药细胞SPC-A1/DTX较SPC-A1存在差异表达2倍以上的miRNA共6条，在耐药细胞中分别下调高表达的miR-192、miR-424、miR-98和分别上调低表达的miR-200b、miR-194、miR-212后，仅miR-200b过表达组LC3-Ⅱ/Ⅰ表达显著降低。 8.miR-200b在耐药细胞H1299/DTX中表达也显著低于亲本细胞（约下调2.81倍）;上调SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中miR-200b表达并给予多西他赛或顺铂处理后，自噬水平均明显降低;下调SPC-A1和H1299细胞中miR-200b表达可促进自噬发生，给予多西他赛或顺铂处理后，自噬水平进一步提高。 9.自噬基因ATG12为miR-200b下游靶基因，其在耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX中均呈现高表达。在亲本细胞中下调miR-200b或在耐药细胞中上调miR-200b后，ATG12mRNA和蛋白表达均出现相应负向调控改变。 结论： 1.自噬参与肺腺癌细胞化疗耐药形成，抑制自噬能提高肺腺癌细胞对多西他赛的敏感性，抑制增殖并促进凋亡。 2.多西他赛促进肺腺癌细胞核内HMGB1转位至胞质，抑制HMGB1胞质转位或下调HMGB1表达抑制细胞自噬，并在体内、外部分逆转肺腺癌化疗耐药，伴随增殖受限，凋亡增加。HMGB1通过MEK/ERK1/2信号通路促进Beclin-1-PI3KⅢ复合体形成上调自噬水平，从而参与肺腺癌化疗耐药形成。 3.MiR-200b为肺腺癌细胞中参与自噬调控的miRNA。miR-200b通过直接结合自噬基因ATG12的3’-UTR区抑制自噬，并逆转体内外肺腺癌化疗耐药。 4.本研究首次从翻译后及转录后水平分别探索HMGB1/MEK/ERK1/2/Beclin-1-PI3KⅢ及miR-200b/ATG12信号通路调控自噬参与肺腺癌耐药形成的分子机制，为肺腺癌的个体化治疗和逆转肺腺癌耐药提供新的临床策略。