目的及意义肝硬化是一种以肝组织弥漫性纤维化、假小叶形成和再生结节形成为特征的慢性肝病。临床上有多系统受累,以肝功能损害和门静脉高压为主要表现,晚期常出现消化道出血、肝性脑病、继发感染等严重并发症。肝硬化是我国常见疾病和主要死亡病因之一,我国肝硬化占内科总住院人数的4.3%-14.2%,发病高峰在35—48岁,男女比例约为3.6—8:1,严重影响患者健康与生命。治疗上,目前临床尚无特效药,平日可用维生素和消化酶,并针对门脉高压及并发症等给予对症支持处理。近年来对于肝硬化的治疗,一些学者研究制定了防治肝纤维化策略,并且已经开始探索从发病机制入手的基因调控与治疗,但只是在动物实验中有进展,抗肝纤维化、肝硬化的临床治疗尚未有突破,所以进一步探讨抗肝纤维化、肝硬化特别是中药领域有更重要的意义。在我国,灵芝药用已有2000多年的历史,其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药,现代药理研究表明,灵芝孢子粉具有许多的药理作用:抗肿瘤、增加免疫调节、保护肝脏、抗病毒、对神经系统的影响、降血糖、降血脂、镇痛、抗缺氧能力、抗炎等。另外,灵芝类产品在大量的动物试验中,无论在急性毒性方面、长期摄入引起对机体的损害方面和致突变及对子代胚胎的发育方面,均未见有毒性表现的报道。可以认为,灵芝是安全无毒并无潜在致突变性及无对子代产生不良影响的。本实验拟初步观察灵芝孢子粉对大鼠肝硬化的影响,为临床上预防和治疗肝硬化提供有意义的基本的实验依据和参考。实验材料与方法1主要药物与仪器灵芝孢子粉由东北长白山红星农场提供;四氯化碳、羧甲基纤维素钠(分析纯)等均购自南方医科大学试剂中心;全自动生化分析仪,型号:ECHOLCO,厂家:乐高特。2分组与给药实验中采用完全随机化的分组方法,将实验动物分成4组,即对照组、模型组,灵芝孢子粉低剂量组、灵芝孢子粉高剂量组。对照组及模型组按10ml/kg体质量每日灌胃灌胃给予0.9%氯化钠溶液(NS),灵芝孢子粉低剂量组按10ml/kg体质量每日灌胃给予0.05%灵芝孢子粉悬浊液,灵芝孢子粉高剂量组按10ml/kg体质量每日灌胃予0.20%灵芝孢子粉悬浊液。3模型需造模组大鼠灌胃同时按0.3ml/100g体质量给予40%四氯化碳菜籽油溶液2周,2周后改为50%四氯化碳菜籽油溶液,应用2周,从第5周改为60%四氯化碳菜籽油溶液,应用4周,腹腔注射,每周2次。第1、2周给予5%乙醇溶液作为饮用水,第3、4周给予10%乙醇溶液作为饮用水,第5～8周给予20%乙醇溶液作为饮用水(乙醇溶液由上述白酒加蒸馏水配制)。共诱导8周,给予普通颗粒饲料及葵花籽喂养,复制大鼠肝硬化动物模型;同时通过监测体重初步估计肝功能有无衰竭的可能,以降低造模造成的死亡率。4观察、检测指标实验至8周末,禁食、不禁水16小时,10%水合氯醛麻醉,开腹经腹主动脉留取动脉血的样本约5 ml,离心取血清以进行血生化等检测;取脏器(肝脏、脾脏),使用1/10000的电子称称量脏器湿重以计算脏器指数;将肝脏取材修剪后放入10%福尔马林中固定,以制作病理切片。5统计方法实验数据均以均数±标准差((?)±S)表示,数据用SPSS13.0统计软件进行处理。血液生化学、脏器湿重和脏器系数等数据,采用One-Way ANOVA;方差齐性时各组之间多重比较采用LSD检验;方差不齐时采用近似方差分析Welch法,各组之间多重比较采用DunnettT3检验。以上检验以P＜0.05为差异有统计学意义。结果与分析1实验至8周末,对照组大鼠营养状况良好,行为、运动状态未见明显异常,摄食、摄水及大便未见明显异常,眼、耳、鼻、口未见异常分泌物,被毛色白,对外界刺激的反应正常,逃跑1只大鼠。模型组大鼠腹部膨隆,毛质粗糙,消瘦,精神萎靡,动作迟钝,易激惹,个别大鼠趾甲易出血,有的大鼠头颈背部、眼眶周围及前肢出现轻度脱毛,毛色光亮,脱毛处皮肤颜色、质地未见异常,死亡5只大鼠,死亡率为25%。灵芝孢子粉低剂量组死亡3只大鼠,死亡率为15%;灵芝孢子粉高剂量组死亡1只大鼠,死亡率为5%。2大鼠体质量方面,随着大鼠肝硬化的加重,大鼠体质量明显减轻,四组的大鼠体质量之间差异有统计学意义,F=58.678,P＜0.001,模型组、灵芝孢子粉低剂量组、灵芝孢子粉高剂量组与对照组之间差异有统计学意义(P值均为P＜0.001),灵芝孢子粉低剂量组、灵芝孢子粉高剂量组与模型组之间差异有统计学意义(P=0.029,P=0.014)。表明造模导致大鼠体质量下降,经灌胃给予灵芝孢子粉后大鼠体质量下降比模型组少。3脏器指数方面,造模后肝指数及脾指数均增大,模型组、灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组与对照组相比存在显著性差异(P值均为P＜0.05);对于肝指数,灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组与模型组比较有显著性差异(P=0.001,P=0.000)。上述实验结果提示,经灌胃给予灵芝孢子粉后大鼠肝纤维化程度较模型组轻,肝、脾淤血有所减轻。4对于反映肝细胞有无受损及严重程度的指标AST及ALT,结果显示,经四氯化碳菜籽油溶液造模后,大鼠AST、ALT均升高;统计显示:模型组、灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组与对照组比较有显著性差异(P值均为P＜0.001),灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组与模型组比较有显著性差异(P值均为P＜0.05)。上述实验结果提示,经灌胃给予灵芝孢子粉后四氯化碳对大鼠肝细胞的损害程度较模型组为轻。5对于反映肝细胞蛋白合成代谢功能指标,结果显示,对于ALB,造模后ALB均降低,模型组、灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组均与对照组有显著性差异(P=0.001,P=0.043,P=0.007),灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组的ALB与模型组差异不显著,但灵芝孢子粉低剂量组及高剂量组的ALB均高于模型组。上述实验结果提示,经四氯化碳菜籽油溶液复制大鼠肝硬化模型后,肝脏合成蛋白能力下降,经灌胃给予灵芝孢子粉后肝细胞蛋白合成代谢功能只是逐渐在恢复。球蛋白增高程度与肝脏疾病严重性相关,故对于GLB,灵芝孢子粉低剂量组、灵芝孢子粉高剂量组与模型组有显著性差异(P=0.009,P=0.043);而对于A/G值,对照组、灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组均与模型组有显著性差异(P=0.000,P=0.000,P=0.003)。6对于反映肝脏排泄、分泌及解毒功能的指标TBIL,结果显示,造模后TBIL均升高,模型组、灵芝孢子粉低剂量组及灵芝孢子粉高剂量组均与对照组有显著性差异(P=0.001,P=0.026,P=0.004)。7组织学检查,取肝脏组织,以10%甲醛溶液固定和石蜡包埋制成切片,HE染色,光镜下观察可见:(1)模型组大鼠肝小叶正常结构破坏,肝间质广泛纤维组织增生,假小叶形成,即大鼠肝硬化动物模型复制成功,成模率为70%。同时可见肝细胞增生反应明显,间质内弥漫性炎细胞浸润。(2)治疗组大鼠肝小叶结构因纤维组织分割而紊乱,但纤维组织间隔细窄,炎细胞较少,原肝小叶没有被完全分割,镜下未见假小叶形成。根据以上研究我们可以得出以下初步结论:(1)在整体水平上,本实验证实灵芝孢子粉对四氯化碳复制的肝硬化大鼠的体质量、脏器指数及肝脏的血生化指标均有影响,可以降低肝硬化大鼠的脏器指数、氨基转移酶、胆红素,增加其体质量、血浆蛋白的合成。(2)在组织水平上,本实验证实灵芝孢子粉对四氯化碳复制的肝硬化大鼠的肝脏纤维化程度有所减轻。