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子宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一,高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是其发生发展的必要条件。HPV16是主要的致癌病毒亚型,其早期调控蛋白E6/E7在宫颈上皮恶性转化过程中具有重要作用。本研究通过构建小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的HPV16E6/E7基因稳定沉默细胞株,探讨了E6/E7癌基因对子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、凋亡及相关周期因子的影响;通过构建cyclinD1基因真核表达载体,转染SiHa细胞,初步研究了cyclin D1过表达对子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖及相关周期因子的影响。首先设计siRNA序列,构建E6/E7shRNA质粒转染SiHa细胞,G418筛选、鉴定,获得E6/E7基因稳定沉默细胞株cm-16,设立空质粒细胞株B3为空白对照。利用QT-PCR和RT-PCR分别检测SiHa/B3/cm-16细胞E6/E7基因mRNA的表达水平、Western blot检测SiHa/B3/cm-16细胞E6/E7蛋白的表达。检测得到cm-16细胞E6/E7基因沉默效率分别为89%、82%,确定shRNA序列可随质粒载体整合至SiHa细胞基因组DNA上,在转录水平诱导E6/E7基因的沉默。其后利用MTT法、RT-PCR法、免疫组织化学法检测SiHa/cm-16细胞的增殖情况,利用TUNEL/流式细胞学技术检测Si Ha/cm-16细胞的凋亡情况。MTT法检测结果显示cm-16细胞增殖速度降低。利用rt-pcr法、免疫组织化学法检测ki67在siha/cm-16细胞中的变化,结果显示ki67在cm-16细胞中的表达显著降低。e6/e7基因沉默后,细胞凋亡增加。利用rt-pcr法对子宫颈癌siha/cm-16细胞周期相关因子进行检测,结果显示在cm-16细胞中cyclind1/cdk4/p21/cdk2/vimentin基因mrna水平表达上升,p27/cycline/e-cadherin基因mrna水平表达降低,其它周期因子无显著变化。利用qt-pcr、免疫组织化学法检测cyclind1在子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中基因及蛋白的表达,结果显示hpv阳性的子宫颈癌中cyclind1低表达或不表达;采用rt-pcr、westernblot、免疫组织化学方法检测siha/cm-16/hcc94细胞中cyclind1基因及蛋白的表达,结果显示在高表达e7基因的siha细胞中cyclind1低表达,在不表达e7基因的hcc94细胞中cyclind1高表达,在沉默e6/e7的cm-16细胞中cyclind1表达升高。为深入探讨cyclind1在siha细胞中的作用,构建cyclind1-pcdna3.1质粒转染siha细胞,筛选cyclind1稳定过表达细胞系g-3,同时空质粒转染siha细胞获得细胞c-2。应用rt-pcr法对siha及g-3细胞相关周期因子进行检测,结果显示在g-3细胞中p21/cdk2/p27/cycline/vimentin表达升高,e-cadherin表达降低,e6/e7及其他细胞因子无显著差异。说明cyclind1过表达可能具有促进宫颈鳞癌细胞上皮间质转化的作用。利用mtt法、rt-pcr法检测siha/g-3细胞的增殖情况,结果显示g-3细胞增殖加快,ki67表达增加,表明cyclind1过表达可能具有促细胞增殖作用。本实验构建了SiHa细胞E6/E7基因稳定沉默细胞系,与国内相关报道相比沉默效率较高,这为子宫颈癌发生发展的分子机制研究奠定基础。通过建立SiHa细胞cyclinD1稳定过表达细胞系,初步探讨了HPV相关子宫颈癌及癌前病变中cyclinD1表达降低的分子机制。其中cyclinD1与子宫颈鳞癌细胞上皮间质转化的关系,国内尚未见同类报道。