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目的:肺栓塞(pulmonary embolism,PE)发病急,病死率高,严重威胁人类的健康与生命,为目前常见致死性血管性疾病之一。PE是静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)的直接死因,其通常继发于深静脉血栓(deep venous thrombosis,DVT)。研究表明VTE有原发性和/或继发性危险因素参与,其中约有60%涉及原发性危险因素。目前法医病理肺栓塞检案中涉及继发性危险因素的案例屡见不鲜,但对于确定两类危险因素并存的案件中危险因素参与度尚存在一定困难。而原发性危险因素的检测与评估,对确定其在复杂疑难肺栓塞案件中的参与度有指导作用,目前针对肺栓塞死亡案例原发性危险因素的法医学鉴定尚缺乏依据。本研究拟选取致命性肺栓塞案例为研究对象,通过分析血栓形成过程中相关基因位点突变情况及其病理学变化,探讨其变化规律,研究复杂肺栓塞的原发性危险因素筛查体系,以期为该类案件提供分子遗传学的评估指标,也为法医病理肺栓塞鉴定死因分析提供新的理论依据。方法:1样本收集:选取2016-2017年河北医科大学法医鉴定中心16例汉族肺栓塞致死案例患者作为实验组,样本选择标准为:1)相关VTE病史,2)尸体解剖及病理诊断肺栓塞;12例非肺栓塞死亡患者作为对照组,样本选择标准为:1)年龄性别与实验组相匹配,2)既往无DVT和PE病史,3)尸体解剖无血栓形成。2实验方法2.1肺栓塞相关基因位点突变检测提取实验样本静脉血,用试剂盒对样本静脉血进行全基因组DNA提取,并进行DNA定量,PCR扩增样本DNA,PCR产物纯化回收。选取血栓形成相关基因4个单核苷酸多态性(SNP)位点:血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)rs668,血栓调节蛋白基因(THBD)rs16984852;蛋白C基因(PROC)rs146922325,rs199469469;2个外显子:内皮细胞蛋白C受体(EPCR)基因第4外显子;PROS1基因第10号外显子。通过对上述SNP位点和外显子进行测序,检测基因突变分布情况和差异性,分析其变化规律。2.2血栓病理染色肺栓塞组分别依据rs668,rs16984852基因分型结果分组。血栓组织经固定、脱水、透明、包埋、连续切片等处理后做HE染色,CD34和α-SMA免疫组织化学染色,观察不同基因型个体血栓中CD34和α-SMA的表达情况。3统计学分析实验数据用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,经卡方检验分析实验组和正常对照组基因型及等位基因分布差异的统计学意义,Logistic回归分析SNP基因型与肺栓塞形成的关系。采用单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法作两两比较,分析不同基因型CD34和α-SMA差异性,以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1肺栓塞相关基因位点突变检测1.1 PECAM-1基因rs668基因型CC、CG和GG在肺栓塞组的分布分别为:2例(12.5%)、12例(75.0%)、2例(12.5%);等位基因C和G各为:50.0%。在对照组的分布率分别为:2例(16.7%)、2例(16.7%)、8例(66.6%)。等位基因C和G分别为:25.0%、75.0%。肺栓组CG基因型频率明显高于对照组。肺栓塞组与对照组比较各基因型差异有统计学意义(P<0.05),Logistic回归分析CG基因型与肺栓塞相关,能显著增加肺栓塞风险(P<0.05)。1.2 THBD基因rs16984852基因型GG、GT和TT在肺栓塞组的分布分别为:4例(25.0%)、12例(75.0%)、0;等位基因G和T频率分别为62.5%、37.5%。在对照组的分布分别为:8例(75.0%)、4例(25.0%)和0;等位基因G和T频率分别为83.3%、16.7%。肺栓塞组GT基因型频率明显高于对照组;肺栓塞组和对照组等位基因型差异有统计学意义(P<0.05)。1.3 PROC基因rs146922325基因型肺栓塞组和对照组全部为CC型,rs199469469肺栓塞组和对照组全部为CTT碱基插入突变。EPCR-4和PROS1-10外显子测序未见基因突变位点。其中肺栓塞组有2例、对照组5例样本发现EPCR第4外显子存在132碱基CG基因型改变;对照组2例样本54位碱基为AG,其余各组位点未发现改变。2血栓病理染色2.1 HE染色肺栓塞组内各基因型均可见:腘静脉内混合血栓增生与管壁界限不清,血栓机化,新生小血管穿透入血栓,血栓部分再通。肺动脉内网络大量红细胞和纤维蛋白的红色血栓,血栓与管壁界限清晰。2.2 CD34免疫组织化学染色rs668、rs16984852各基因型组均可见腘静脉血栓组织CD34阳性表达,rs668 CG型组阳性细胞数量明显多于CC型和GG型组,且CG型组与其他两组比较有明显差异(P<0.05)。rs16984852 GT型组阳性细胞数量明显多于GG型组,两组间比较有明显差异(P<0.05)。2.3α-SMA免疫组织化学染色rs668、rs16984852各基因型组均可见腘静脉血栓组织α-SMA阳性表达,rs668 CG型组阳性细胞数量与CC型和GG型组比较有明显差异(P<0.05)。rs16984852 GT型组与GG型组比较有明显差异(P<0.05)。结论:1 PECAM-1基因rs668和THBD基因rs16984852是本实验人群的易感SNP位点,CG和GT基因型分别为主要的危险基因型,与PE相关,有望作为原发性肺栓塞的基因突变筛查位点。PROC基因rs146922325和rs199469469可能不是本人群肺栓塞的易感SNP位点,EPCR-4和PS-10外显子中可能不存在肺栓塞相关SNP位点。2 rs668 CG和rs16984852 GT突变可能通过增加成纤维细胞和血管内皮细胞来影响血栓的机化和再通过程。