论文部分内容阅读
作为呼肠孤病毒科轮状病毒属的猪轮状病毒(Porcine rotavirus, PRV),是导致幼龄仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一。PRV在全世界各地广泛的流行,刚断奶仔猪是最容易感染的,主要的临床表现是比较严重的腹痛腹泻。猪轮状病毒(PRV)能使仔猪呕吐、拉肚子、失水、碱酸失衡。部分染上了PRV的仔猪会继发其他细菌的混合感染,造成病仔猪死亡率上升,给各地养猪行业造成很大的经济亏损。考虑到在外衣壳的糖蛋白VP7是PRV中一个很重要的蛋白,发挥着举足轻重的作用,为了更进一步的了解PRV的生物学功能,进行了如下的工作内容：在本次研究中,将阳性质粒pET-30a-VP7转进E. coli BL21中,IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE分析,表达的蛋白产物主要以包涵体的形式存在,分子量大小是37kDa。Western-blot验证了猪轮状病毒VP7蛋白具有很高的免疫原性。通过大肠杆菌原核表达及纯化PRV DN30209株重组VP7蛋白接种BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术,把免疫鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。经间接ELISA检测筛选出阳性克隆,再通过有限稀释阳性孔进行亚克隆,制备出针对猪轮状病毒VP7的单克隆抗体(MAb)3B6。抗体亚类检测结果证实,3B6株属于IgG2b亚类。间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹试验(Western blot)表明,MAb3B6可以和猪轮状病毒VP7蛋白及PRV感染的细胞发生反应。在酶联免疫吸附试验(ELISA)中单克隆抗体能从多种病毒中特异性地识别PRV,而不与其他病毒反应。噬菌体展示技术在抗原鉴定、表位筛选、受体及配体功能区鉴定等方面已被广泛应用。MAb3B6纯化腹水作为靶分子,按照随机噬菌体十二肽库说明书进行筛选,采用了依次递减包被抗体的浓度,缩短结合时间和逐步增加洗涤液中Tween-20的浓度,而保持投入噬菌体的量基本不变的方法来提高选择强度,从而达到得到高亲和力噬菌体的目的,从而使与抗体结合的特异性噬菌体得到了明显的富集。在四轮筛选后,ELISA验证挑取的阳性噬菌体与包被单克隆抗体的亲和能力,十个噬菌体拥有共同的外源肽序列"VPLGTDNGDIWV",而且对于靶分子具有很高的亲和力。噬菌体展示的十二肽与VP7蛋白进行序列比对,结果说明十二肽中有四个氨基酸(第167位P、第178位T、第179位D和第184位W)与VP7蛋白的167-184位氨基酸有一定的相似性。MAb3B6抑制ELISA证明合成的亲和多肽降低了猪轮状病毒与抗VP7单克隆抗体之间的作用,由这4个氨基酸所构成的基序很有可能作为猪轮状病毒VP7蛋白的一个模拟表位。