壳聚糖生物活性载体的生物相容性研究及对脊髓神经干细胞的诱导分化

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目的:研究一种具有能够诱导脊髓神经再生功能的壳聚糖生物活性载体的生物相容性及生物活性载体对脊髓神经干细胞的诱导分化作用。方法:从新生24小时乳鼠体内分离脊髓神经干细胞,进行体外培养、传代。通过MTT比色法绘制细胞生长曲线。对脊髓神经干细胞的鉴定选用干细胞特异性标记物巢蛋白--nestin;并且进行单克隆培养说明干细胞克隆形成率。经单纯10%血清诱导脊髓神经干细胞分化后的第1、4、7天进行NF、GFAP和MBP免疫细胞化学染色分别标记神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。分化第7日,于高倍镜(400×)下,连续计数总细胞数和阳性细胞数,统计三种细胞的各自分化比例。生物活性载体与脊髓神经干细胞在体外共培养7天后行MTT实验检测生物活性载体的生物相容性。同时,在载体与细胞共培养7天后进行扫描电镜观察。四种生物活性载体分别诱导脊髓神经干细胞分化,分化7天时分别对三种细胞行免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,并按上述方法计数细胞分化比例。用胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫细胞化学染色鉴定分化神经元。流式细胞检测生物活性载体对脊髓神经干细胞诱导分化为神经元的分化比例。结果:成功在体外分离培养了脊髓神经干细胞,通过nestin免疫组化和单克隆培养鉴定其干细胞特性。MTT实验和扫描电镜结果显示出生物活性载体与神经干细胞共培养后细胞生长旺盛,形成突起,相互连接成网状,证实了载体良好的生物相容性。脊髓神经干细胞单纯经10%血清诱导(对照组)可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,计数神经元分化比例为32.00%;而A、B、C、D四种生物活性载体诱导干细胞(实验组)的分化比例依次为37.45%、38.20%、35.10%和41.57%,统计分析可知:除了A和B之间没有统计学差异,其它组间比较具有统计学差异,尤其是四组试验组与对照组之间有显著性差异。流式细胞检测神经元分化比例得出结果与上相同。脊髓神经干细胞在生物活性载体培养体系下可被诱导分化为胆碱能神经元,可同时表达神经元细胞核特异性抗体NeuN和胞浆抗体ChAt。结论:成功在体外分离培养了新生鼠的脊髓神经干细胞;生物活性载体对脊髓神经干细胞具有良好的生物相容性,可诱导脊髓神经干细胞向胆碱能神经元分化比例增加,为脊髓重建再生管(其内含生物活性载体)修复脊髓提供理论支持。
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