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磷脂酰胆碱(PC)作为膜磷脂的一种,与其他磷脂及膜蛋白等成分共同构成细菌的生物膜系统。实验室先前的研究发现,PC在细菌致病方面起重要的作用,如丁香假单胞菌丁香致病变种1336pcs-突变体缺少PC,导致丁香假单胞菌1336几乎丧失了致病能力。丁香假单胞菌丁香致病变种 1336(Pseudomonas syrigae pv.Syringa.van Hall CFCC 1336)致病能力的减弱与脂肽类毒素分泌量减少密切相关。脂肽毒素主要是通过细菌I型分泌系统(TISS)分泌到胞外。TISS由外膜蛋白(OMP),胞质膜融合蛋白(MFP),ABC转运子(ABC transporter)三部分组成。为了进一步探究PC是否通过影响I型分泌系统(TISS)机器的构件蛋白在细胞质内的表达或在细胞膜上的组装,导致TlSS机器工作异常,进而影响了脂肽毒素的分泌,我们做了如下研究工作:1.克隆、外源表达和纯化丁香假单胞菌丁香致病变种1336 PseE/PseF外排系统组件蛋白。依椐丁香假单胞菌丁香致病变种 B728a(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)的psyr2617(pseE),psyr2618(pseF)基因序列,设计特异性引物,从丁香假单胞菌丁香致病变种1336基因组中扩增pseE和pseF基因。基因测序分析比较发现,丁香假单胞菌丁香致病变种1336和丁香假单胞菌丁香致病变种B728a的pseE和pseF基因同源性分别达到95%和96%。分别将克隆的pseE、pseF基因插入表达载体pET23a和pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS并进行诱导表达,然后通过Co2+柱亲和层析纯化并获得纯净的PseE、PseF蛋白。2.制备抗PseE、PseF蛋白的兔抗多克隆抗体。将纯化的PseE,PseF蛋白分别注射新西兰大耳兔,收集血清,获得兔抗PseE、PseF蛋白多克隆抗体。3.研究PC对PseE、PseF蛋白在细胞质内表达的影响。分别提取丁香假单胞菌丁香致病变种1336野生型和1336pcs突变型胞质总蛋白,并与制备的抗PseE、PseF蛋白的多克隆抗体进行Western blot免疫印迹反应。结果显示,PC缺失基本不影响pseE,pseF基因转译水平。4.研究PC对PseE,PseF蛋白在膜上组装的影响。分别提取丁香假单胞菌丁香致病变种1336野生型和1336pcs-突变型膜蛋白,并与制备的抗PseE、PseF蛋白的多克隆抗体进行Western blot杂交。比较发现,PC缺失对PseE,PseF蛋白在膜上的组装有较大影响,细菌缺少PC,PseE,PseF蛋白不能有效地在细菌细胞膜中组装。5.研究PC对ps声沾、pseF基因转录的影响。分别设计反转录酶PCR(RT-PCR)特异性引物pseE-rt-F,pseE-rt-R,pseF-rt-F,pseF-rt-R,并提取丁香假单胞菌丁香致病变种1336野生型和1336pcs-突变体总RNA。通过反转录反应得到cDNA,并以cDNA为模板,用设计的特异性引物进行RT-PCR。结果发现,细菌缺少PC,不影响pseE、pseF基因的正常转录。6.研究PC对脂肽毒素合成相关基因转录的影响。使用反转录酶PCR技术,分析比较sypA、sypB、sypC、salA、pseA、pseB、pseC、syrB1、syrC、syrE、syrF、syrG 基因在丁香假单胞菌丁香致病变种1336野生型和1336pcs-突变体细胞中的转录,发现PC缺失不影响脂肽毒素合成相关基因的转录。结论:细菌膜磷脂中磷脂酰胆碱的缺失既不影响脂肽毒素合成相关基因的转录也不影响pseE:、pseF基因的转录和转译水平,但影响PseE,PseF蛋白有效地在细菌细胞膜中组装。缺少PC的丁香假单胞菌丁香致病变种1336pcs突变体不能有效地分泌脂肽毒素是由于T1SS中的PseE/PseF外排系统的PseE和PseF蛋白不能正常地在细菌膜中组装造成的。