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目的:体外刺激扩增培养的γδT细胞杀伤肝癌细胞效果及机制探讨和体内验证。方法:1.肝素抗凝静脉血经密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)之后,在体外分五组进行刺激扩增,实验对照组分两组,一组只加白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),另一组加植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA),实验组加磷酸化抗原1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-基-4-二磷酸(1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate,HDMAPP)、唑来膦酸(zoledronic acid,ZOL)和结核分枝杆菌耐热抗原(mycobacterium tuberculosis heat resistant antigen,Mtb-HAg),其中PHA主要刺激活化αβT细胞,HDMAPP、ZOL、Mtb-HAg刺激活化γδT细胞。各组分别加入IL-2发挥维持增殖的作用。并实时镜下观察形态变化。2.流式测定体外培养12天后对照组和实验组中γδT细胞在T细胞中所占比例。细胞毒实验,选择γδT细胞作为效应细胞,Hep G2细胞为靶细胞,流式测定并比较体外刺激扩增培养后效靶比分别为0:1,10:1,40:1时的杀伤率。活细胞工作站观察杀伤作用的动态变化。3.探讨γδT细胞杀伤机制,使用自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)活化性受体NKG2D(natural-killer group2,member D,NKG2D)阻断剂阻断效应细胞识别靶细胞,细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)1/2的特异性抑制剂PD98059阻断胞内信号途径。4.分两批建立裸鼠肿瘤模型,绘制瘤体生长曲线,小动物成像仪检验成瘤效果,验证γδT细胞的体内杀伤作用。结果:γδT细胞在T细胞中约占1-10%,流式测定PBMC中γδT细胞在T细胞中的比例为(4.64±0.37)%,在正常范围内。体外刺激扩增培养γδT细胞至12天时,三个实验组中γδT细胞均出现大量扩增,扩增效率可达90%,实验组和对照组表现出明显地差别(P<0.01),其中HDMAPP和ZOL刺激扩增起来的γδT的比例明显高于Mtb-HAg组(P<0.05)。在杀伤实验中,随着效靶比增加,杀伤效果也递增,实验组ZOL刺激扩增的γδT细胞杀伤率明显高于HDMAPP组和Mtb-HAg组(P<0.05)。在活细胞工作站下观察到动态的杀伤过程,在图像中靶细胞可见明显萎缩、坏死。阻断实验中验证了NKG2D阻断剂和ERK1/2信号通路阻断剂的阻断作用,其中,运用PD98059后且效靶比为40:1时,各实验组均出现杀伤阻断作用,可见PD98059阻断作用强于NKG2D阻断剂(P<0.05)。三组实验组中,在HDMAPP组中,当效靶比为40:1时,NKG2D阻断剂表现出了明显地阻断杀伤的作用(P<0.05)。在ZOL组中,当效靶比为10:1时,运用PD98059处理效应细胞后,表现出了明显地阻断杀伤的作用(P<0.05),更进一步说明了PD98059的主要阻断作用,也可以说明在效应细胞杀伤肝癌细胞时,胞内信号途径起重要的作用。体内实验验证了γδT细胞的杀伤作用。根据肿瘤生长曲线,实验组和对照组在细胞治疗后出现差异(P<0.05),且小动物成像仪中对照组出现肿瘤,而实验组中却没有显示肿瘤信号。结论:HDMAPP、Mtb-HAg和ZOL可实现体外刺激扩增γδT细胞的目的,其中HDMAPP和ZOL扩增效率可达90%以上。HDMAPP、Mtb-HAg和ZOL刺激扩增起来的γδT细胞对Hep G2均有杀伤作用,ZOL和Mtb-HAg刺激扩增起来的γδT细胞杀伤率高于HDMAPP组。比较而言,ZOL扩增效率高,杀伤肿瘤细胞效果好。