副溶血弧菌是引起海产品源食物中毒的最主要致病菌,其常与水产品中的优势腐败菌——腐败希瓦氏菌共存于近岸海水和海产品中。在与腐败希瓦氏菌共培养体系中,副溶血弧菌的溶血活性、耐热直接溶血毒素基因(tdh)、生物被膜等毒力因子表达量显著增加,致病力也显著增强,但其相互作用机制尚不清楚。由于群体感应在细菌毒力因子表达与细菌菌群相互作用中有重要调控作用,本研究从群体感应角度研究腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制。1.以副溶血弧菌ATCC33847为亲本株,利用同源重组技术分别构建副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株VPΔLuxM、VPΔLux S,通过氯霉素抗性、菌落PCR和DNA测序对基因敲除突变株进行验证;比较VPΔLuxM、VPΔLuxS与亲本株的生长表型、溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成能力等生物学特性差异。结果显示,副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株VPΔLuxM、VPΔLuxS构建成功;VPΔLux M的生长较亲本株弱,其溶血活性、tdh基因表达量、生物被膜形成量较亲本株显著增加(p<0.05),VPΔLux S的溶血活性、tdh基因表达量较亲本株显著降低(p<0.05),生物被膜形成量较亲本株显著增加(p<0.05)。研究表明,副溶血弧菌的群体感应信号分子合成酶基因luxM对其溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成有调控抑制作用,对其生长有正向调控作用;副溶血弧菌的群体感应信号分子合成酶基因luxS对其溶血活性、tdh基因表达有正向调控作用,对生物被膜形成有调控抑制作用。2.分别建立腐败希瓦氏菌菌体、腐败希瓦氏菌上清提取物与副溶血弧菌亲本株、突变株VPΔLuxM、VPΔLux S的共培养体系,对比腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌亲本株、突变株的溶血活性、tdh基因表达、生物被膜等毒力因子作用效应,从群体感应角度研究腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制。相对溶血活性结果显示,腐败希瓦氏菌上清提取物对ATCC33847、VP△LuxM、VP△LuxS的溶血活性均有显著增强作用(p<0.05),分别增加了1.51倍、1.24倍、2.46倍。VP△Lux S在腐败希瓦氏菌菌体、腐败希瓦氏菌上清提取物共培养体系中的溶血活性规律与ATCC33847相同。实时荧光定量PCR法检测各体系下ATCC33847、VP△LuxM、VP△Lux S的tdh基因表达量可知,腐败希瓦氏菌菌体对ATCC33847、VP△LuxM、VP△Lux S的tdh表达均有显著增强作用(p<0.05),分别增加了2.46、7.66、1.51倍,腐败希瓦氏菌上清提取物对ATCC33847、VP△Lux M、VP△Lux S的tdh表达量分别增加了1.60、17.68、1.14倍。vp△luxm在腐败希瓦氏菌菌体、腐败希瓦氏菌上清提取物共培养体系中的溶血活性规律与atcc33847相同。结晶紫法检测各体系中的生物被膜可知,腐败希瓦氏菌上清提取物对atcc33847、vp△luxm、vp△luxs生物被膜形成能力均有显著减弱作用(p<0.05),分别降至原来的0.84、0.53、0.75;腐败希瓦氏菌上清提取物、腐败希瓦氏菌菌体的加入对vp△luxm生物被膜的影响效应与atcc33847相同;荧光原位杂交及显微镜观察生物被膜结构可知,vp△luxm、vp△luxs的生物被膜较atcc33847致密、团聚成蘑菇状,腐败希瓦氏菌上清提取物的加入使atcc33847、vp△luxm、vp△luxs被膜结构更厚实、聚成团状,腐败希瓦氏菌菌体的加入使atcc33847、vpΔluxs、vpΔluxm的生物被膜结构变得松散。结果表明,腐败希瓦氏菌可能通过其产生的ahls信号分子竞争性结合至副溶血弧菌luxm群体感应系统或者通过某种代谢产物降解副溶血弧菌ahls信号分子影响副溶血弧菌的溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成;或者腐败希瓦氏菌通过其产生的ai-2信号分子结合至副溶血弧菌luxs群体感应系统影响其溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成。3.对腐败希瓦氏菌与atcc33847、vp△luxm、vp△luxs共培养体系中的ahls信号分子、ai-2信号分子、溶血活性、生物被膜进行动态测定,研究腐败希瓦氏菌-信号分子-副溶血弧菌毒力因子的级联作用,建立lc-ms/ms法检测ahls信号分子,对atcc33847与腐败希瓦氏菌的ahls信号分子谱(种类、含量)进行对比研究。溶血活性体系研究结果显示,ahls信号分子随细菌生长代谢逐渐累积,ai-2信号分子量在细菌生长期至稳定期随菌体量增加逐渐增加,30h以后降解、总量减少;腐败希瓦氏菌与vp△luxs共培养体系的溶血活性随其ai-2信号分子量变化,与其ahls信号分子量无明显相关性。生物被膜体系研究结果显示,ai-2信号分子量随生物被膜被膜增加/衰弱呈现相应的增、减,腐败希瓦氏菌与vp△luxs共培养体系的生物被膜随其ai-2信号分子量变化,与其ahls信号分子量无明显相关性。腐败希瓦氏菌产生c6-hsl(23.47μg/l)、c12-hsl(3.49μg/l)、3-oxo-c12-hsl(0.37μg/l)信号分子;atcc33847产生c4-hsl(11.79μg/l)、3-oxo-c6-hsl(0.46μg/l)、3-oxo-c14-hsl(0.62μg/l)信号分子。结果表明,腐败希瓦氏菌通过其产生的某种代谢产物降解副溶血弧菌ahls信号分子影响副溶血弧菌的溶血活性、tdh表达、生物被膜形成,或者通过其产生的ai-2信号分子结合至副溶血弧菌luxs群体感应系统影响其溶血活性、tdh基因表达、生物被膜形成。综上,本研究从群体感应角度研究了腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力因子的影响机制,证实了群体感应在副溶血弧菌溶血活性、tdh基因表达及生物被膜等毒力因子表达中具有重要调控作用,为副溶血弧菌毒力因子与致病力控制提供理论支持与指导;证实了腐败希瓦氏菌通过其产生的某种代谢产物降解副溶血弧菌AHLs信号分子影响其毒力因子表达,或者通过其产生的AI-2信号分子结合至副溶血弧菌Lux S群体感应系统影响其毒力因子表达,可作为菌群间相互作用效应研究及其机制研究的理论支撑;本研究建立的LC-MS/MS法检测AHLs信号分子以及构建的副溶血弧菌群体感应信号分子合成酶基因luxM、luxS敲除突变株VPΔLuxM、VPΔLux S将为副溶血弧菌群体感应系统的后续研究及其它群体感应系统相关研究奠定基础。