【摘 要】
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目的:多巴胺（Dopaminergic,DA）神经元分化的潜在机制尚未完全阐明。本研究试图分析小鼠上胚层干细胞（Epiblast stem cells,Epi SCs）产生的外泌体中microRNA（miRNA）和mRNA的表达情况,揭示外泌体在DA神经元命运决定中的作用。方法:EpiSCs在添加了SHH和FGF8的N2B27培养基中增殖,通过单层分化（Monolayer differentiat
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目的:多巴胺（Dopaminergic,DA）神经元分化的潜在机制尚未完全阐明。本研究试图分析小鼠上胚层干细胞（Epiblast stem cells,Epi SCs）产生的外泌体中microRNA（miRNA）和mRNA的表达情况,揭示外泌体在DA神经元命运决定中的作用。方法:EpiSCs在添加了SHH和FGF8的N2B27培养基中增殖,通过单层分化（Monolayer differentiation,MD）的方法建立起DA神经元分化模型,分别在MD0,2,4,6,8,10,12,14天从细胞培养上清液中分离、纯化外泌体,分析其中miRNAs、m RNAs的动态表达情况,针对差异表达的miRNAs,运用DIANAmir Path方法进一步分析下游的靶基因和作用通路。此外,将Epi SCs分化过程中产生的外泌体与小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）共孵育,分析ESCs的DA神经元分化效率。结果:在DA神经元分化的第0、2、4、6、8、10、12和14天,26个miRNAs在外泌体中差异表达（相对倍数＞2,p＜0.05）。其中,miR-124、miR-132、miR-133b、miR-218、miR-9、miR34b、miR-34c和miR-135a2等23个外泌体miRNAs与对照相比表达显著增加,而miR-214、miR-7a和miR-302b这3个miRNAs表达显著减少。DIANA-mir Path生物信息学分析表明,DA分化相关的miRNAs主要集中在细胞外基质-受体相互作用、干细胞多能性调节信号通路、Fox O信号通路、DA突触、Wnt信号通路、GABA能突触以及神经营养因子信号通路（p值均＜0.012）。随着时间的推移,9种DA神经元标志物——酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）、Nr4a2、Pitx3、Drd1a、Lmx1a、Lmx1b、Foxa1、Dmrt5和Slc18a2的m RNAs在Epi SCs来源外泌体中表达显著增加。更重要的是,在小鼠ESCs向DA神经元分化的过程中,加入Epi SC诱导分化实验中的外泌体,可使TH阳性神经元的产量增加两倍（35%vs.17%,p＜0.01）。结论:在EpiSC向DA神经元分化过程中,外泌体特定miRNAs和m RNAs的表达随时间而动态变化,并发挥对DA神经元分化的潜在调节作用。Epi SC来源的外泌体可在体外促进ESCs向DA神经元分化。
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