乳酸在白酒酿造过程由酿酒微生物代谢产生,是酒醅中最主要的不挥发性有机酸之一,也是影响酱香型白酒酒醅酸碱环境的主要物质。乳酸积累与酒醅酸度环境密切相关,并直接影响微生物群落的演变和发酵进程的走向。因此,乳酸对酱香型白酒的风味和酿造微生物群落结构的平衡具有重要作用,酿造过程中能否控制乳酸在适宜浓度直接影响到酱香型白酒的品质。酱香型白酒两次投料、七个轮次取酒中间不再补料,酒醅中的乳酸具有不易挥发、多轮次积累的特点。解析乳酸生成机制和调控乳酸代谢,并且保证乳酸积累在适宜浓度范围,对酱香型白酒的生产具有重要的指导意义。然而,酱香型白酒酿造过程主要产乳酸微生物不明确、优势微生物乳酸代谢途径及其调控机制不清晰以及微生物群落乳酸代谢调控方法的缺乏限制了酱香型白酒中乳酸代谢机制解析与调控。本论文针对酱香型白酒酿造过程产乳酸优势微生物的鉴定、乳酸代谢途径调控机制的解析以及乳酸调控策略的开发与应用开展研究。通过对酱香型白酒酒醅的微生物多样性进行分析,分离鉴定了酱香型白酒生产过程中主要的产乳酸微生物,并解析了环境因素对其乳酸合成的影响机理。在此基础上,采用恒温常压等离子体(ARTP)诱变及高通量筛选技术获得产乳酸能力不同的诱变菌株,并且通过比较基因组学技术,解析其产酸能力差异的分子机制。通过模拟发酵实验对产乳酸能力不同的诱变菌株扰动发酵过程菌群结构、调控乳酸合成及在制酒生产中的应用进行验证,最终提出制酒生产中乳酸生成调控策略,并通过制酒生产试验进行了验证。本文主要研究成果如下:(1)采用16S rDNA高通量扩增子测序技术分析乳酸显著积累的造沙轮次窖内发酵过程中原核微生物群落多样性,结果表明在0-7天发酵过程中,酒醅的优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)和乳酸菌属(Lactobacillus、Pediococcus等);而到中后期,乳杆菌属(Lactobacillus)是酒醅的绝对优势菌属。采用改良MRS培养基和改良LB培养基分离得到乳酸菌151株,分属于10个种;芽孢杆菌84株,分属于5个种。其中乳酸菌中以Lactobacillus panis的比例最高,占分离的乳酸菌数量的67.5%,其次是Lactobacillus plantarum,占乳酸菌总量的7.3%。同时,分离得到的5种芽孢杆菌中Bacillus amyloliquefaciens占芽孢杆菌数量的一半以上。综合分析不同乳酸菌和芽孢杆菌产酸能力及其在微生物群落中所占比例,鉴定L.panis为窖内发酵过程中优势产乳酸微生物,分离获得菌株命名为L.panis L7。(2)通过Illumina HiSeq 4000测序平台对L.panis L7进行全基因组测序,并且对测序数据进行基因组组装、基因预测和功能注释。通过基因组拼接得到127个基因组骨架(scaffolds),总长度为2,026,099 bp,GC平均含量为47.0%。基因组中总共注释1,932个基因、51个t RNA和2个rRNA。对乳酸代谢相关途径解析发现L.panis L7的乳酸代谢途径为专性异型乳酸发酵,其发酵产物为D,L-乳酸和乙酸等其他副产物。对L.panis L7在不同环境条件下的生长、乳酸产量及乳酸合成路径相关基因表达情况的分析表明,L.panis具有较高的耐热能力,温度对其产乳酸能力无显著影响;乳酸对L.panis L7的乳酸合成有促进作用;乙醇对L.panis L7的生长和乳酸产量均具有显著的抑制作用,且抑制效果会随着乙醇浓度的增加而增加;葡萄糖对L.panis L7的作用则随着葡萄糖浓度的升高而呈先促进后抑制的作用。L.panis L7对环境因素的乳酸代谢响应与酱香白酒工艺的特点相符,表明该菌在酱香型白酒生产过程中实现了定向驯化。(3)通过ARTP诱变L.panis L7获得突变株文库,进一步通过高通量筛选获得了一株高产乳酸突变菌株R6和一株低产乳酸突变菌株R13,乳酸产量分别提高21%和降低11%。通过比较基因组学分析了R6、R13与出发菌株L.panis L7之间的差异,结果表明谷氨酸消旋酶基因murI、甲基化DNA蛋白半胱氨酸甲基转移酶基因ybaZ、富马酸还原酶黄素蛋白亚基基因frdA以及氨基磷酸核糖转移酶基因purF产生的突变是提高乳酸生物合成潜在的关键基因;果糖激酶基因rbsK、核糖激酶基因scrK、精氨琥珀酸裂解酶基因argH和大亚基核糖体蛋白L30基因rpmD产生的突变是降低乳酸生物合成潜在的关键因素。(4)在制酒生产试验中应用上述不同产乳酸能力的L.panis突变株扰动窖内发酵过程菌群并且调控乳酸合成。结果表明,在发酵过程中强化不同产乳酸能力的L.panis突变株,能显著提升酒醅乳酸含量,而对酒醅微生物群落结构、Lactobacillus比例,以及乙酸、乙醇和风味物质组成等无明显影响。利用突变菌株R6扰动窖内发酵过程菌群时,在窖内发酵14天时,乳酸浓度提高23.6%。因此,通过在酒醅中添加L.panis可以提高酒醅乳酸含量,实现乳酸调增的目标。(5)强化低产乳酸突变菌株R13扰动窖内发酵过程菌群并不能实现乳酸调减的目标,因此通过大曲中乳酸菌含量调控,建立了有效降低发酵过程乳酸含量的方法。与对照相比,利用热处理方式控制大曲中乳酸菌的接种量,能有效减少发酵过程乳酸菌的增长繁殖,使窖内发酵过程中试验班组Lactobacillus含量逐渐减少,其占比由入窖时的80%降至出窖时的60%,出窖时乳酸浓度降低31.9%,从而显著降低发酵过程乳酸的生产,减少酸度积累,实现了酿造过程减少乳酸含量的效果,建立了调减策略。而且控制大曲中乳酸菌的数量对产量影响小,同时基酒品质接近对照班组。